建立HIRI小鼠模型
在体内评估髓系Cdc42缺失对肝缺血再灌注损伤的影响。
使用Cdc42mye和Cdc42flox小鼠建立HIRI模型，缺血1小时再灌注12小时，检测血清ALT/AST、肝组织学、肝细胞凋亡、氧化应激指标。
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小鼠髓系Cdc42缺失通过抑制巨噬细胞介导的炎症保护肝脏免受肝缺血再灌注损伤
Myeloid Deletion of Cdc42 Protects Liver From Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury via Inhibiting Macrophage-Mediated Inflammation in Mice
实验完整度
高包含体内HIRI模型、髓系特异性敲除小鼠、体外BMDMs/巨噬细胞极化实验、流式、Western blot、mIF等多层级验证，并明确机制通路。
主要模型
Cdc42mye小鼠（髓系Cdc42敲除） C57BL/6小鼠HIRI模型 BMDMs（骨髓来源巨噬细胞） RAW264.7细胞 THP1细胞
重点核对
小鼠品系：Cdc42mye（LyzCre介导的髓系Cdc42敲除）与Cdc42flox对照 HIRI模型：缺血1小时，再灌注12小时 ML141剂量：10 μM体外，10 mg/kg腹腔注射 M1诱导：LPS 100 ng/mL ± IFN-γ 20 ng/mL；M2诱导：IL4 ± IL13（40 ng/mL） 检测指标：ALT/AST、肝坏死、巨噬细胞浸润、M1/M2标志物、STAT1/3/6磷酸化
摘要
背景与目的：肝缺血再灌注损伤（HIRI）常发生在肝脏手术中，如部分肝切除术和肝移植，其中髓系巨噬细胞介导的炎症起关键作用。细胞分裂周期42（Cdc42）调节细胞迁移、细胞骨架重排和细胞极性。在本研究中，我们探讨髓系Cdc42在HIRI中的作用。方法：在髓系Cdc42敲除（Cdc42mye）和Cdc42flox小鼠中建立小鼠HIRI模型，缺血1小时后再灌注12小时。髓系来源的巨噬细胞通过LyzCre介导的切除用RosamTmG荧光报告基因进行追踪。进行了血清或肝脏酶活性、组织学和免疫学分析、基因表达、流式细胞术分析和细胞因子抗体阵列实验。结果：髓系Cdc42缺失显著减轻了小鼠HIRI后的肝脏损伤，减少了肝坏死和炎症，并保留了肝功能。髓系Cdc42缺乏抑制了髓系巨噬细胞的浸润，减少了促炎细胞因子的分泌，抑制了M1极化，促进了肝脏中髓系巨噬细胞的M2极化。此外，Cdc42的失活通过抑制STAT1的磷酸化并促进STAT3和STAT6的磷酸化，促进了髓系巨噬细胞的M2极化。此外，用Cdc42抑制剂ML141预处理也能保护小鼠免受肝缺血再灌注损伤。结论：抑制或缺失髓系Cdc42通过抑制髓系巨噬细胞的浸润、抑制促炎反应和促进巨噬细胞的M2极化来保护肝脏免受HIRI。关键词：肝缺血再灌注损伤，细胞分裂周期42（Cdc42），巨噬细胞，极化
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 髓系Cdc42在肝缺血再灌注损伤（HIRI）中的作用及其机制。
- 核心机制
- 髓系Cdc42缺失或抑制通过抑制STAT1-SOCS3信号轴、增强STAT3和STAT6的磷酸化，促进巨噬细胞从M1向M2极化转变，从而抑制促炎反应。
- 主要证据
- 基于Cdc42mye小鼠HIRI模型，发现Cdc42缺失减少巨噬细胞浸润、降低促炎细胞因子、抑制M1极化并促进M2极化；体外实验在BMDMs、RAW264.7和THP1中证实Cdc42调控STATs-SOCS3通路。
- 研究意义
- 该研究揭示了Cdc42作为巨噬细胞M1-M2极化开关的关键调节因子，为缓解HIRI提供了新思路或潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
追踪髓系巨噬细胞浸润
验证Cdc42缺失对HIRI后髓系巨噬细胞迁移的影响。
利用Rosa mTmG/LyzCre报告小鼠追踪EGFP阳性髓系细胞，并通过CD11b免疫荧光染色观察巨噬细胞分布。
评估巨噬细胞极化
确定Cdc42缺失对M1/M2极化的影响。
通过mIF染色检测肝组织中CCR2、CD11b、CD86、iNOS和CD206的表达；通过免疫组化检测CD206；Western blot检测IL6、IL10、iNOS、ARG1。
检测炎症反应
评估Cdc42缺失对全身及肝脏炎症的影响。
进行血常规分析、流式细胞术检测中性粒细胞和单核细胞比例，qRT-PCR检测肝脏促炎因子（TNF-α、IL1β、IL6）和CD206表达，细胞因子抗体阵列检测血清细胞因子。
体外验证Cdc42对巨噬细胞极化的影响
进一步确认Cdc42缺失或抑制对巨噬细胞极化的直接作用。
分离Cdc42flox和Cdc42mye小鼠的BMDMs，用LPS或IL4刺激；RAW264.7和THP1细胞用ML141预处理后刺激；检测炎症因子表达和极化标志物。
机制探究：STATs-SOCS3通路
阐明Cdc42调控巨噬细胞极化的分子机制。
Western blot检测THP1和BMDMs中STAT1、STAT3、STAT6的磷酸化及SOCS3表达。
ML141体内给药实验
验证Cdc42抑制剂在体内是否模拟基因敲除的保护效果。
通过腹腔注射ML141（10 mg/kg）预处理小鼠，随后建立HIRI模型，评估肝损伤和巨噬细胞极化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 肝功能检测 | ALT/AST检测 | Servicebio | -- |
| 氧化应激检测 | MDA检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-1-2 |
| SOD检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-3-2 | |
| 肝功能检测 | LDH检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 |
| 组织学分析 | TUNEL检测试剂盒 | Elabscience | E-CK-A320 |
| 免疫组织化学/免疫荧光 | CD206抗体 | PTM BIO | PTM-6020 |
| CD11b抗体 | -- | 21851-1-AP | |
| 荧光显微镜 | 奥林巴斯BX63显微镜 | Olympus | -- |
| 多重免疫荧光 | 多重免疫荧光试剂盒 | AiFang Biological | AFIHC025 |
| CD206抗体 | Proteintech | 18704-1-AP | |
| CD11b抗体 | Proteintech | 21851-1-AP | |
| iNOS抗体 | Proteintech | 22226-1-AP | |
| CCR2抗体 | Proteintech | 16153-1-AP | |
| CD86抗体 | Proteintech | 13395-1-AP | |
| 细胞培养 | 重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| cDNA合成 | M-MLV逆转录酶 | Promega | -- |
| qRT-PCR | SYBR Green Master Mix | Roche Diagnosis | -- |
| ABI/ViiA7实时荧光定量PCR系统 | -- | -- | |
| 细胞因子检测 | 小鼠细胞因子抗体芯片试剂盒 | Abcam | ab133993 |
| 细胞培养/处理 | ML141 | -- | -- |
| 细胞培养 | 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯 | Sigma | -- |
| 细胞因子处理 | 重组小鼠IL4 | Peprotech | -- |
| 重组小鼠IL13 | Peprotech | -- | |
| 流式细胞术 | 染色缓冲液 | BD | 554656 |
| CD11b-APC抗体 | BD | 550019 | |
| CD64-FITC抗体 | BD | 555527 | |
| CD86-FITC抗体 | BD | 557343 | |
| CD206-FITC抗体 | BD | 551135 | |
| Ly6C-PE/Cy7抗体 | BioLegend | 128017 | |
| Ly6G-APC抗体 | BioLegend | 127613 | |
| CD11b-FITC抗体 | BioLegend | 101205 | |
| CD86-PE抗体 | BioLegend | 105106 | |
| CD206-PerCP/Cy5.5抗体 | BioLegend | 141716 | |
| CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| Western blot | iNOS抗体 | Proteintech | 22226-1-AP |
| ARG1抗体 | Proteintech | 66129-1-AP | |
| IL10抗体 | Proteintech | 60269-1-Ig | |
| IL6抗体 | CST | 12912S | |
| SOCS3抗体 | Proteintech | 14025-1-AP | |
| STAT抗体套装 | CST | 9939T | |
| 磷酸化STAT抗体套装 | CST | 9914T | |
| 数据分析 | ImageJ | -- | -- |
| 流式数据分析 | FlowJo v10.0 | -- | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 9.0 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系：Cdc42mye（LyzCre介导敲除）与Cdc42flox对照；年龄：8-12周；性别：雄性；HIRI：缺血1小时再灌注12小时 阅读提示：Methods: Animal Strains and Genotyping; HIRI Modeling |
| 细胞模型 | BMDMs分离自Cdc42mye和Cdc42flox小鼠；RAW264.7细胞；THP1细胞（PMA 50 ng/mL预处理48小时分化）；培养条件 阅读提示：Methods: Isolation and Culture of BMDMs; Flow Cytometry Analysis |
| 药物处理 | ML141浓度：体外10 μM预处理2小时；体内10 mg/kg腹腔注射，12小时间隔两次，第一次后24小时进行HIRI 阅读提示：Methods: Results - Inhibition of Cdc42 Protects Mice from HIRI; Figure 9 legend |
| 巨噬细胞极化诱导 | M1诱导：LPS 100 ng/mL ± IFN-γ 20 ng/mL；M2诱导：IL4和/或IL13（40 ng/mL）；刺激时间 阅读提示：Methods: Figure 6 and 7 legends; Results |
| 检测指标 | 肝功能：ALT, AST, LDH, MDA, SOD；炎症因子：TNF-α, IL1β, IL6；极化标志：CD86, iNOS (M1), CD206, ARG1 (M2)；信号通路：p-STAT1, p-STAT3, p-STAT6, SOCS3 阅读提示：Methods: Evaluation of Hepatic Function; qRT-PCR; Western Blot; Results |