单核转录组和表观组分析
描绘胎盘不同细胞类型及STB细胞核的异质性
对12个胎盘样本进行snRNA-seq和snATAC-seq，鉴定细胞类型并分析差异表达基因和染色质可及性。
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人类胎盘合体滋养层细胞单核多组学分析揭示妊娠期间细胞轨迹
Single-nucleus multi-omic profiling of human placental syncytiotrophoblasts identifies cellular trajectories during pregnancy
实验完整度
高整合snRNA-seq和snATAC-seq多组学分析，结合smFISH、CUT&Tag、ChIP-seq及hTSC和类器官功能验证，涵盖体外模型、患者样本和功能实验。
主要模型
早期和晚期人类胎盘组织样本 人类滋养层干细胞（hTSCs-BL和hTSCs-CT30） 滋养层类器官
重点核对
胎盘样本孕周：早期6-9周，晚期38-39周，每阶段6例，且男女均衡 STB亚型标记基因：PAPPA（成熟1型）、FLT1（成熟2型）、SH3TC2（新生型） 关键转录因子：STAT5A（成熟1型）、FOSL2/CEBPB（成熟2型） 体外分化条件：STB培养基含2μM forskolin，4% KSR，分化6天 过表达诱导：DOX浓度5μM，处理时间6天
摘要
人类胎盘在确保成功妊娠中具有重要作用。尽管对其细胞组成和功能的认识不断增长，但对合体滋养层（STB）内数十亿细胞核的异质性研究仍然有限。STB是一个多核实体，主要负责胎盘功能。在这里，我们对来自早期和晚期妊娠的人类胎盘进行了整合的单核RNA测序和单核ATAC测序分析。我们的研究结果表明，STB细胞核具有动态异质性和发育轨迹，并与人类滋养层干细胞（hTSC）衍生的STB相对应。此外，我们通过基因调控网络鉴定了与不同STB细胞核谱系相关的转录因子，并在hTSC和滋养层类器官衍生的STB中实验验证了其功能。总之，我们的数据为人类STB的异质性提供了见解，并代表了解释相关妊娠并发症的宝贵资源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类胎盘合体滋养层（STB）中数十亿细胞核是否具有发育依赖的转录和功能动态异质性，以及其调控机制为何？
- 核心机制
- STB细胞核分化轨迹分叉为两种成熟亚型，分别受STAT5A/MITF和CEBPB/FOSL2等转录因子调控，通过增强子-基因调控网络（eGRN）控制PAPPA和FLT1等关键基因表达。
- 主要证据
- 利用snRNA-seq和snATAC-seq分析101,543个胎盘细胞核，结合smFISH、CUT&Tag和ChIP-seq验证，并在hTSC和滋养层类器官中通过基因过表达实验证实STAT5A和MITF的功能。
- 研究意义
- 提供了人类STB细胞核异质性的全面分析，揭示了新的调控机制，并为解释妊娠相关并发症（如子痫前期）提供了宝贵资源。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
STB亚型鉴定与轨迹推断
鉴定STB细胞核亚型并推断其分化轨迹
对早期妊娠eSTB和eCTB进行亚聚类，使用Monocle2和监督方法进行拟时间分析，鉴定出分叉的发育轨迹。
基因调控网络构建
识别调控STB亚型分化的关键转录因子及其靶基因
使用MACS2调用峰，通过pearson相关性计算峰-基因联系，构建TF-增强子-靶基因调控网络。
体外模型验证
验证hTSC和类器官是否能模拟体内STB异质性和调控机制
将hTSC衍生的STB与体内胎盘数据整合，并进行DOX诱导的STAT5A和MITF过表达，检测靶基因表达变化。
表观调控实验验证
证实eGRN预测的调控事件在体外模型中存在
对STB-BL和hTSC-BL进行CUT&Tag和ChIP-seq，验证CEBPB和FOSL2结合的靶基因区域。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单核分离 | Nuclei EZ裂解液 | Sigma-Aldrich | NUC-101 |
| RNA酶抑制剂 | Takara | 2313B | |
| 蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Dounce组织研磨器 | Sigma-Aldrich | D8938 | |
| snRNA-seq | 单细胞B芯片试剂盒 | 10x Genomics | 1000074 |
| Chromium单细胞控制器 | 10x Genomics | -- | |
| S1000TM Touch热循环仪 | Bio-Rad | -- | |
| 安捷伦4200 | Agilent | -- | |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| snATAC-seq | Chromium E芯片单细胞试剂盒 | 10x Genomics | 1000156 |
| Chromium单细胞ATAC文库和凝胶珠试剂盒 | 10x Genomics | 1000110 | |
| 细胞培养 | I型胶原蛋白 | Corning | -- |
| DMEM/F12培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| ITS-X添加剂 | Gibco | -- | |
| L-抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 表皮生长因子 | MedChemExpress | -- | |
| CHIR99021 | MedChemExpress | -- | |
| A83-01 | MedChemExpress | -- | |
| SB431542 | MedChemExpress | -- | |
| 丙戊酸 | Wako | -- | |
| Y27632 | MedChemExpress | -- | |
| TrypLE消化液 | Gibco | -- | |
| 慢病毒生产 | 聚乙烯亚胺 | Proteintech | -- |
| STB分化 | 毛喉素 | MedChemExpress | -- |
| 基因敲除血清替代物 | Gibco | -- | |
| 多西环素 | MedChemExpress | -- | |
| 类器官培养 | 基质胶 | -- | -- |
| CUT&Tag | CEBPB抗体 | Proteintech | 23431-1-AP |
| FOSL2抗体 | USBiological | 351814 | |
| 兔IgG | Abcam | ab172730 | |
| CUT&Tag检测试剂盒 | Vazyme | TD904 | |
| ChIP-seq | QIAquick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- |
| NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒 | NEB | E7645S | |
| smFISH | RNAscope多通道荧光试剂盒V2 | Advanced Cell Diagnostics | 323100 |
| 显微镜 | 蔡司LSM 880共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 早期和晚期妊娠各6例，孕周分别为6-9周和38-39周，男女均衡 阅读提示：Methods: Description of human placental donors |
| snRNA-seq | 单核悬液浓度600 nuclei/μl，目标回收8000个核，测序深度≥100,000 reads/nucleus 阅读提示：Methods: Library construction and sequencing |
| snATAC-seq | 测序深度≥25k read pairs/nucleus 阅读提示：Methods: Library construction and sequencing |
| hTSC培养 | 培养基成分（EGF 50 ng/ml, CHIR99021 2μM等）和传代比例1:4-1:6 阅读提示：Methods: Culture of hTSCs |
| STB分化 | STB培养基含2μM forskolin和4% KSR，分化6天 阅读提示：Methods: Differentiation of hTSCs into STB |
| 基因过表达 | lentivirus感染MOI（未明确），puromycin筛选浓度2μg/ml，DOX诱导浓度5μM 阅读提示：Methods: Generation of overexpressing hTSCs |