诱导CKD-LVDD猪模型及表型验证
建立CKD-LVDD猪模型并确认其心脏和肾脏表型，以模拟早期心力衰竭。
对猪进行双侧肾动脉狭窄手术和给予致动脉粥样硬化饮食14周，通过超声心动图、MDCT和压力-容积环评估心脏和肾脏功能，并测定BNP、ANP等生物标志物。
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慢性肾脏病与左心室舒张功能障碍改变猪心脏线粒体相关基因的表达
Chronic kidney disease and left ventricular diastolic dysfunction (CKD-LVDD) alter cardiac expression of mitochondria-related genes in swine
实验完整度
高包含体外细胞实验、动物模型、组学测序及电子显微镜和功能验证等多层级证据
主要模型
猪CKD-LVDD模型（双侧肾动脉狭窄+高胆固醇/高碳水化合物饮食） H9c2大鼠心肌母细胞（ATCC CRL-1446）
重点核对
猪模型：双侧肾动脉狭窄诱导CKD，配合高胆固醇/高碳水饮食，持续14周 分组：CKD-LVDD（6只，3公3母）和正常对照（6只，3公3母） 功能学验证：超声心动图、压力-容积环、MDCT分别评估心脏和肾脏参数 分子组学：每组3只猪进行mRNA、MeDIP、miRNA测序，差异表达阈值FC≥2，FDR≤0.05 体外机制验证：H9c2细胞暴露于正常或CKD-LVDD血浆，加入miR-374b-3p抑制剂或TNF-α/IL-6中和抗体
摘要
心血管疾病和心力衰竭在慢性肾脏病（CKD）患者中的发生率翻倍，但其潜在机制仍不清楚。线粒体是维持细胞呼吸和调节心肌细胞功能的核心。我们利用新型猪CKD和左心室舒张功能障碍（CKD-LVDD）模型，研究线粒体相关基因的表达及其潜在调控机制。CKD-LVDD和正常对照猪（每组6只，3公3母）研究14周。分别通过多排探测器CT、超声心动图和压力-容积环研究量化肾脏和心脏血流动力学。通过电子显微镜评估线粒体形态，通过Oroboros评估功能。在随机选择的猪（每组3只）中，进行心脏mRNA、MeDIP和miRNA测序，以鉴定线粒体相关基因并研究其转录前和转录后调控。CKD-LVDD表现出心脏线粒体结构异常和线粒体H2O2释放升高，但线粒体功能保留。心脏mRNA-seq鉴定出862个线粒体相关基因，其中69个上调和33个下调（倍数变化≥2，错误发现率≤0.05）。功能分析显示，上调基因主要涉及氧化应激相关过程，而下调基因主要参与呼吸和ATP合成。整合mRNA/miRNA/MeDIP-seq分析显示，上调基因主要受miRNA调控，而下调基因受miRNA和表观遗传机制调控。CKD-LVDD改变了心脏线粒体相关基因的表达，与线粒体结构损伤但呼吸功能保留相关，可能反映了内在的代偿机制。我们的发现可能指导在心脏功能障碍阶段开发早期干预措施，届时线粒体损伤可被预防，LVDD的发展可得到改善。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CKD-LVDD心脏中线粒体相关基因表达的改变及其可能的调控机制（转录前和转录后）是什么？
- 核心机制
- CKD-LVDD导致线粒体相关基因表达失调，其中上调基因主要受miRNA调控，下调基因受miRNA和5mC/5hmC表观遗传机制共同调控；miR-374b-3p可能通过靶向MLYCD等基因参与线粒体损伤。
- 主要证据
- 猪模型（每组3只）进行mRNA、MeDIP、miRNA测序及整合分析；电子显微镜显示线粒体结构异常；H9c2细胞实验支持miR-374b-3p和炎症因子在改善线粒体功能中的作用。
- 研究意义
- 发现线粒体损伤的转录前和转录后调控机制，为在CKD相关心力衰竭早期阶段开发针对线粒体的干预措施提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
心脏转录组和表观遗传学分析
鉴定CKD-LVDD心脏中差异表达的线粒体相关基因及其调控机制。
对随机选取的每组3只猪的心脏组织进行mRNA-seq、MeDIP-seq和miRNA-seq，通过生物信息学分析鉴定差异表达基因和表观遗传修饰，并整合分析。
线粒体形态和功能分析
评估CKD-LVDD心脏线粒体结构和功能变化。
采用电子显微镜观察线粒体形态，用Oroboros Oxygraph-2k测量线粒体呼吸和H2O2释放，用DHE染色检测心肌超氧阴离子产生。
体外机制验证
验证miR-374b-3p和炎症因子在心肌线粒体损伤中的作用。
将H9c2心肌母细胞暴露于正常或CKD-LVDD猪血浆，分别加入miR-374b-3p抑制剂或TNF-α和IL-6中和抗体，测量线粒体ROS和膜电位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 饮食诱导 | 致动脉粥样硬化饮食 | CorVus Biomedical LLC | -- |
| 压力-容积环测量 | 基于导纳的Advantage导管 | Transonic Systems, Inc. | -- |
| 静脉阻塞 | 球囊阻塞导管 | Edward Life Sciences | -- |
| mRNA测序文库制备 | TruSeq RNA样品制备试剂盒v2 | Illumina | -- |
| DNA提取 | DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| DNA打断 | Bioruptor Pico超声波破碎仪 | Diagenode | -- |
| DNA片段分析 | 片段分析仪 | Advanced Analytical Technologies | -- |
| 高灵敏度NGS片段分析试剂盒 | -- | DNF-486 | |
| MeDIP | 抗5mC抗体 | Diagenode | C15200081 |
| 抗5hmC抗体 | Diagenode | -- | |
| 蛋白G Dynabeads磁珠 | Thermo Fisher | 10003D | |
| ssDNA/RNA清洁和浓缩试剂盒 | Zymo Research | D7010 | |
| Qubit ssDNA高灵敏度检测 | Thermo Scientific | Q10212 | |
| MeDIP文库制备 | ACCEL-NGS 1S Plus DNA文库试剂盒 | Swift Bioscience | 10024 |
| 测序 | HiSeq4000测序仪 | Illumina | -- |
| 线粒体分离 | 蛋白酶 | -- | -- |
| 线粒体功能 | Oroboros Oxygraph-2k高分辨呼吸仪 | Oroboros Instruments | -- |
| Amplex Red试剂 | -- | -- | |
| 辣根过氧化物酶 | -- | -- | |
| 苹果酸 | -- | -- | |
| 谷氨酸 | -- | -- | |
| 腺苷二磷酸 | -- | -- | |
| 琥珀酸 | -- | -- | |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- |
| 体外细胞实验 | H9c2大鼠心肌母细胞 | ATCC | CRL-1446 |
| miR-374b-3p拮抗剂 | Thermo Fisher | MH19946 | |
| 脂质体转染试剂RNAiMAX | Invitrogen | -- | |
| TNF-α中和抗体 | R&D Systems | AF690 | |
| IL-6中和抗体 | R&D Systems | AF686 | |
| MitoSOX线粒体超氧化物指示剂 | Thermo Fisher | M36008 | |
| 四甲基罗丹明乙酯 | Thermo Fisher | T669 | |
| 统计分析 | JMP Pro 14.0统计软件 | SAS Institute Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 猪的年龄、性别、体重，双侧肾动脉狭窄诱导方法，高胆固醇/高碳水饮食的具体成分和持续时间（14周） 阅读提示：Methods 第一段 |
| 在体功能学评价 | 超声心动图指标（LVEF、LV厚度、LV质量指数、应变、E/E'等），MDCT测量方法（对比剂剂量、灌注参数），PV环路测量条件（导管型号、阻断方法） 阅读提示：Methods 第二段和第三段 |
| 转录组测序 | 每组样本数（3只），组织来源（心脏），RNA提取方法和质量控制，差异表达阈值（FC≥2，FDR≤0.05），参考基因组（猪），分析流程（MAP-RSeq、edgeR） 阅读提示：Methods 中 mRNA sequencing 和 Figure 2 legend |
| 表观遗传学测序 | MeDIP-seq和miRNA-seq的文库制备方法，抗体使用（抗5mC/5hmC），峰值识别和差异分析参数（fold-change≥1.4），miRNA差异表达阈值（FC≥2，FDR≤0.05） 阅读提示：Methods 中 MeDIP-sequencing 和 miRNA sequencing |
| 线粒体结构和功能 | 电子显微镜样本处理，线粒体分离缓冲液配方，Oroboros测量协议（底物浓度），H2O2检测方法，DHE染色条件 阅读提示：Methods 中 Electron microscopy 和 Cardiac redox status... |
| 体外机制验证 | H9c2细胞培养条件（培养基、血清浓度），血浆处理浓度和时间，miR-374b-3p抑制剂浓度，TNF-α/IL-6抗体浓度，MitoSOX和TMRE染色时间 阅读提示：Methods 中 Mechanistic studies |