C-CHIME 系统建立和验证
开发并验证双 gRNA 载体能否在体内高效敲除两个基因
构建含两个 gRNA 表达框的慢病毒载体，转导 LSK 细胞后建立骨髓嵌合体，通过流式细胞术和 indel 分析检测 CD2、CD28、Fcgr1、Mertk 的敲除效率。
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X-CHIME 实现免疫系统中基因的组合性、诱导性、谱系特异性和序贯性敲除
X-CHIME enables combinatorial, inducible, lineage-specific and sequential knockout of genes in the immune system
实验完整度
高包含系统建立（C/I/L/S-CHIME 载体和骨髓嵌合体）、功能验证（流式和 indel 分析）、机制探索（PTPN1/PTPN2 双敲除致死、RAG2 实验、scRNA-seq）以及体内模型（肿瘤实验）。
主要模型
C57BL/6J 小鼠骨髓嵌合体 (BMC) Rosa26-Cas9ON 或 H11-Cas9 供体 LSK 细胞 E8I-Cre (CD8 特异性 Cre) 小鼠 RAG2 缺陷小鼠骨髓嵌合体
重点核对
C-CHIME 中双 gRNA 载体的敲除效率（CD2 和 CD28 在 T 细胞中约 90% 降低，Fcgr1 和 Mertk 在巨噬细胞中 58% 敲除） I-CHIME 中他莫昔芬诱导的敲除效率（CD2 在 T 细胞中约 45% 降低，激活后约 75%） L-CHIME 中 CD8 特异性 Cre 介导的敲除效率（CD2 在 CD8+ T 细胞中约 40% 降低，肿瘤浸润 T 细胞中约 82%） S-CHIME 中序贯敲除效率（CD2 诱导性敲除约 65% 降低，CD28 组成性敲除约 90% 降低，双敲除约 60%） PTPN1/PTPN2 组成性双敲除导致骨髓增生低下和致死性，T 细胞和 B 细胞是致死所必需的
摘要
体内免疫基因功能注释通常需要生成基因敲除小鼠，这既耗时又通量低。我们此前开发了 CHimeric IMmune Editing (CHIME)，一种用于组成性、普遍性单基因敲除的 CRISPR-Cas9 骨髓递送系统。在此我们描述 X-CHIME，四种基于 CHIME 的新系统，用于模块化、快速地研究基因功能：组合性 (C-CHIME)、诱导性 (I-CHIME)、谱系特异性 (L-CHIME) 或序贯性 (S-CHIME)。我们使用 C-CHIME 和 S-CHIME 评估成年小鼠中 Ptpn1 和 Ptpn2（一个胚胎致死基因对）联合缺失的后果。我们发现 PTPN1 和 PTPN2 的组成性缺失导致骨髓发育不全和致死性，而免疫发育后的诱导性缺失导致肠炎和致死性。这些发现表明，X-CHIME 可用于在不同体内背景下快速进行基因的机制性评估，并且 PTPN1 和 PTPN2 具有对成年小鼠生存能力重要的功能冗余。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- X-CHIME 系统能否在体内实现组合性、诱导性、谱系特异性和序贯性的基因敲除，并用于研究成年小鼠中胚胎致死基因对 PTPN1 和 PTPN2 的功能？
- 核心机制
- PTPN1 和 PTPN2 在免疫细胞中具有功能冗余，其联合缺失导致造血细胞内在的致死性，依赖于 T 和 B 细胞；组成性缺失引起骨髓增生低下，而免疫发育后的诱导性缺失则导致肠炎。
- 主要证据
- 通过 C-CHIME 和 S-CHIME 在骨髓嵌合体中敲除 Ptpn1 和 Ptpn2，显示组成性双敲除导致骨髓增生低下和死亡，而诱导性序贯双敲除导致肠炎和死亡；RAG2 缺陷背景下的双敲除小鼠存活，证明 T/B 细胞参与致死性。
- 研究意义
- X-CHIME 提供了一种快速、模块化的平台，可在体内对造血细胞进行组合性和时间性基因扰动，有助于理解基因功能及潜在的治疗性研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
I-CHIME 系统建立和验证
开发并验证可诱导的基因敲除系统，实现时间控制
构建含 loxP 或 FRT 侧翼转录终止子的 gRNA 载体，使用 Cre-ERT2 或 FlpO-ERT2 小鼠，通过他莫昔芬诱导重组，检测 CD2 敲除效率和泄漏情况。
L-CHIME 系统建立和验证
开发并验证 CD8+ T 细胞特异性基因敲除系统
使用 E8I-Cre 小鼠和 loxP-STOP-loxP-gRNA 载体，建立骨髓嵌合体，检测 CD2 在 CD8+ T 细胞中的敲除效率和特异性。
S-CHIME 系统建立和验证
开发并验证一个基因组成性敲除、另一个基因诱导性敲除的序贯系统
构建含两个 gRNA 的载体，其中第一个 tracrRNA 含 FRT-stop-FRT，利用 FlpO-ERT2 诱导重组，检测 CD2 诱导性敲除和 CD28 组成性敲除的效率。
PTPN1/PTPN2 组成性双敲除的表型分析
评估成年小鼠造血细胞中 PTPN1 和 PTPN2 双敲除的后果
使用 C-CHIME 敲除 Ptpn1 和 Ptpn2，监测小鼠生存、血液学参数、病理变化和单细胞转录组。
PTPN1/PTPN2 序贯双敲除的表型分析
评估免疫发育后序贯双敲除 PTPN1 和 PTPN2 的效应
使用 S-CHIME 组成性敲除 Ptpn1，诱导性敲除 Ptpn2，他莫昔芬处理后监测体重、生存和组织病理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 慢病毒生产 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 24765-2 |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| 细胞培养 | DMEM 培养基 | Gibco | 11995073 |
| 胎牛血清 | Sigma | F2442 | |
| 青霉素/链霉素 | VWR | 97063-708 | |
| 骨髓嵌合体 | CD117 磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-091-224 |
| Retronectin | Takara Bio | T100B | |
| 流式分析 | 近红外死活染料 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 链霉亲和素 | Biolegend | -- | |
| TruStain fcX | Biolegend | -- | |
| DNA 提取 | DNeasy 血液和组织试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| PCR 纯化 | QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28106 |
| 药物处理 | 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648-5G |
| 葵花籽油 | Sigma-Aldrich | S5007-250ML | |
| T 细胞培养 | Naive CD8a+ T 细胞分离试剂盒 | Miltenyi | 130-096-543 |
| 抗 CD3 抗体 | -- | -- | |
| 抗 CD28 抗体 | -- | -- | |
| 白细胞介素-2 | VWR | 103717-092 | |
| 肿瘤实验 | 三溴乙醇 | VWR | AAA18706-22 |
| 肿瘤浸润淋巴细胞分离 | 胶原酶 I 型 | Worthington Biochemical | LS004194 |
| Optiprep 梯度 | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| 核转染 | Cas9 蛋白 | IDT | 1081059 |
| P3 缓冲液 | Lonza | V4XP-3024 | |
| 核转染杯 | Lonza | V4XP-3024 | |
| 细胞因子分析 | BD CBA 小鼠炎症因子检测试剂盒 | BD | 552364 |
| 坏死组织学 | Bouin 固定液 | Sigma-Aldrich | HT10132-1L |
| 成像 | Hamamatsu ORCA-Flash4.0 V3 数字 CMOS 相机 | Hamamatsu | -- |
| 尼康 Ti 倒置显微镜 | Nikon | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 骨髓嵌合体建立 | 供体小鼠品系（Rosa26-Cas9ON 或 H11-Cas9）、LSK 细胞分选门控、慢病毒转导 MOI（30）、受体辐照剂量（1200 rad）、细胞移植数量（约 50,000 LSK） 阅读提示：Methods: Bone marrow isolation and bone marrow chimera setup |
| C-CHIME 敲除 | gRNA 序列、双 gRNA 载体构建、敲除效率（CD2/CD28 约 90%，Fcgr1/Mertk 约 50%）、indel 检测方法 阅读提示：Results: C-CHIME enables KO of two genes in diverse immune lineages; Figure 1 |
| I-CHIME 诱导敲除 | 他莫昔芬剂量（2 mg 连续 3 天）、给药途径（腹腔）、诱导时间窗口、敲除效率（CD2 约 45%，激活后约 75%）、转录终止子切除效率 阅读提示：Results: I-CHIME enables inducible deletion of genes in T cells; Figure 2 |
| L-CHIME 谱系特异性敲除 | E8I-Cre 小鼠、loxP-stop-loxP-gRNA 载体、CD8+ T 细胞中敲除效率（约 40%，激活后约 60%）、肿瘤浸润 T 细胞中敲除效率（约 82%） 阅读提示：Results: Specific deletion of genes in CD8+ T cells using L-CHIME; Extended Data Fig. 3 |
| S-CHIME 序贯敲除 | 载体含一个 FRT-stop-FRT 和一个组成性 gRNA、他莫昔芬诱导后 CD2 敲除效率（约 65%）、CD28 组成性敲除效率（约 90%）、双敲除效率（约 60%） 阅读提示：Results: S-CHIME enables sequential KO of paired genes; Figure 3 |
| PTPN1/PTPN2 双敲除表型分析 | gRNA 序列（Ptpn1, Ptpn2）、骨髓嵌合体构建、生存监测时间点、病理分析、RAG2 缺陷小鼠的使用 阅读提示：Results: DKO of PTPN1 and PTPN2 leads to bone marrow hypoplasia; Figure 4 |
| 序贯双敲除肠炎模型 | S-CHIME 载体（Ptpn1 组成性，Ptpn2 诱导性）、他莫昔芬处理时机（骨髓重建后 8 周）、体重监测、小肠病理分析 阅读提示：Results: Sequential DKO of PTPN1 and PTPN2 leads to enteritis; Figure 5 |