全基因组shRNA筛选鉴定ALDH18A1
发现细胞在谷氨酰胺剥夺条件下能够继续增殖所必需的基因。
使用MycER MEF细胞系，感染小鼠TRC2 shRNA文库，在无谷氨酰胺培养基中培养约20天，筛选出能增殖的克隆，通过测序分析富集的shRNA。
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抑制脯氨酸代谢限速酶P5CS使得谷氨酰胺受限的癌细胞能够增殖
Inhibition of the proline metabolism rate-limiting enzyme P5CS allows proliferation of glutamine-restricted cancer cells
实验完整度
高包含全基因组shRNA筛选、体外细胞实验、代谢示踪、TCGA数据分析、异种移植模型及患者样本免疫组化等多层级验证。
主要模型
MycER MEF细胞 人胃癌细胞系NUGC2 人前列腺癌细胞系PC3 人子宫内膜癌细胞系MFE-280
重点核对
P5CS敲低在谷氨酰胺剥夺条件下的增殖优势（图1E-F） 谷氨酰胺合成酶抑制剂MSO对P5CS敲低细胞增殖的阻断作用（图2F） α-KG、ASN和核苷酸联合补充对野生型细胞在无谷氨酰胺培养基中增殖的恢复（图3E） P5CS敲低在异种移植模型中的肿瘤生长优势（图4H） 人肿瘤样本中P5CS与GS表达的负相关（图5E-H）
摘要
谷氨酰胺是快速增殖细胞的关键代谢物，因为它用于合成细胞生长和增殖所需的关键代谢物。谷氨酰胺代谢已被提议作为癌症的治疗靶点，并且几种化学抑制剂正在开发中或处于临床试验阶段。当谷氨酰胺受限时，细胞如何维持生存尚不清楚。通过一项无偏筛选，我们鉴定出ALDH18A1，其编码脯氨酸生物合成途径中的限速酶P5CS，是细胞响应谷氨酰胺饥饿而下调的基因。值得注意的是，P5CS下调促进谷氨酰胺的从头合成，这凸显了癌细胞先前未被认识的代谢可塑性。通过减少脯氨酸合成保留的谷氨酸使得细胞能够产生在谷氨酰胺受限条件下细胞存活和增殖所必需的关键代谢物。我们的发现揭示了一种癌细胞在营养应激下获得的适应途径，将脯氨酸生物合成鉴定为谷氨酰胺的主要消耗者，这一途径可被用于开发有效的代谢驱动的抗癌疗法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 癌细胞在谷氨酰胺受限条件下如何适应并维持增殖？
- 核心机制
- 下调脯氨酸生物合成限速酶P5CS，将谷氨酸转向谷氨酰胺从头合成（由谷氨酰胺合成酶催化），并产生天冬酰胺和核苷酸等下游代谢物，从而支持细胞存活和增殖。
- 主要证据
- 全基因组shRNA筛选鉴定出ALDH18A1；在MycER MEFs及人类癌细胞中敲低P5CS后，细胞在无谷氨酰胺培养基中增殖；15N和13C示踪显示谷氨酰胺从头合成增加；补充α-KG、ASN和核苷酸可恢复野生型细胞增殖；异种移植实验显示P5CS敲低肿瘤生长更快。
- 研究意义
- 揭示脯氨酸生物合成是谷氨酰胺的主要消耗者，为开发针对谷氨酰胺代谢的癌症治疗策略提供新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证P5CS敲低的功能
确认Aldh18a1（P5CS）的下调足以使细胞在谷氨酰胺剥夺条件下增殖。
在MycER MEFs中稳定敲低Aldh18a1，观察谷氨酰胺剥夺条件下的增殖情况；同时利用CRISPR敲除小鼠肾上皮细胞中的Aldh18a1进行验证。
代谢组学分析揭示代谢重编程
探究P5CS敲低细胞在谷氨酰胺限制条件下的代谢变化。
使用15NH4Cl和13C5-谷氨酰胺/谷氨酸进行稳定同位素标记，结合LC-MS分析代谢物标记模式。
补充代谢物恢复增殖实验
确定哪些下游代谢物是谷氨酰胺剥夺条件下细胞增殖所必需的。
在野生型MycER MEFs中，于无谷氨酰胺培养基中单独或联合补充α-KG、天冬酰胺（ASN）、N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）和核苷酸，观察增殖恢复情况。
体内异种移植实验
评估P5CS下调在体内肿瘤生长中的作用。
将NUGC2对照、P5CS敲低和P5CS回补细胞皮下注射到免疫缺陷小鼠，测量肿瘤体积随时间的变化；另用预适应的MKN45和EN细胞进行双 flank 实验。
患者样本分析
探究人类肿瘤中P5CS和GS表达的相关性。
对胃腺癌和子宫浆液性癌切片进行免疫组化和免疫荧光染色，检测P5CS和GS的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | L-甲硫氨酸亚砜亚胺 | Sigma-Aldrich | -- |
| CB-839 | Selleck Chemicals | -- | |
| 细胞培养 | L-脯氨酸 | Sigma-Aldrich | -- |
| L-天冬酰胺 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 二甲基-α-酮戊二酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| N-乙酰-D-氨基葡萄糖 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 核苷（胞苷、胸苷、尿苷、腺苷、鸟苷） | Sigma-Aldrich | -- | |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 聚凝胺 | Millipore Sigma | -- | |
| 转染 | Mirus TransIT-293转染试剂 | Mirus Bio | -- |
| X-tremeGENE 9 DNA转染试剂 | Millipore Sigma | -- | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Lipofectamine 2000 CD | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 筛选 | 4-羟基他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | H7904 |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| 抗P5CS抗体 | Proteintech | 17719-1-AP | |
| 抗P5CDH抗体 | Proteintech | 11604-1-AP | |
| 抗GS抗体 | Sigma-Aldrich | G2781 | |
| 抗ASNS抗体 | Proteintech | 14681-1-AP | |
| 抗MYC抗体 | Abcam | ab32072 | |
| 抗LDHA抗体 | Cell Signaling | 2012S | |
| 抗总H3抗体 | Abcam | ab1791 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T6199 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A5316 | |
| 增强化学发光 | GE Healthcare | -- | |
| 代谢组学 | 氯化铵-15N | Millipore Sigma | -- |
| 13C5-谷氨酰胺 | Cambridge Isotope | CLM-1822-H-0.25 | |
| 13C5-谷氨酸 | Cambridge Isotope | CLM-1800-H-0.25 | |
| 代谢组学氨基酸混合标准品 | Cambridge Isotope Laboratories | -- | |
| Zic-pHILIC色谱柱 | -- | -- | |
| TraceFinder软件 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Compound Discoverer软件 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Xcalibur软件 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 气相色谱-质谱联用仪 (7890A) | Agilent Technologies | -- | |
| 动物实验 | 基质胶 | Corning | 354234 |
| NOD SCID小鼠 | Jackson Laboratories | 001303 | |
| 免疫组化 | 抗P5CS抗体 | Novus Biologicals | NBP1-88324 |
| 抗GS抗体 | Millipore Sigma | MAB302 | |
| 流式细胞术 | 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞增殖检测 | CyQUANT细胞增殖检测试剂盒 | Thermo Scientific | C7026 |
| NADPH/NADP+检测 | NADP/NADPH检测试剂盒 | Abcam | ab65349 |
| DNA提取 | DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| PCR | Phusion高保真DNA聚合酶 | NEB | M0530 |
| PCR纯化 | QIAquick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 |
| 凝胶提取 | QIAquick凝胶提取试剂盒 | Qiagen | 28704 |
| 凝胶过滤 | Illustra MicroSpin G-25离心柱 | GE Healthcare | 27-5325-1 |
| 定量 | Qubit双链DNA高灵敏度试剂盒 | Life Technologies | -- |
| 测序 | Illumina HiSeq2500测序仪 | Illumina | -- |
| 显微镜 | Leica DMI4000 B显微镜 | Leica | -- |
| 流式细胞术 | BD FACSARIA III流式细胞分选仪 | BD | -- |
| 图像扫描 | Aperio Scanscope XT扫描仪 | Leica Biosystems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 全基因组shRNA筛选 | MycER MEF细胞系来自Ralph DeBerardinis；TRC2文库覆盖度；筛选时间约20天；谷氨酰胺剥夺培养基中FBS浓度（提供约50μM谷氨酰胺）；筛选重复数（3次）。 阅读提示：Methods: shRNA screening, library preparation, and NextGen sequencing |
| 细胞培养与谷氨酰胺剥夺 | 细胞培养基成分（无谷氨酰胺DMEM, 10% FBS, 1%青霉素-链霉素）；谷氨酰胺剥夺条件（无额外添加，基础FBS提供约50μM）；补充物浓度（MSO 1mM, CB-839 10μM, α-KG 7mM等）；细胞密度（MycER MEFs 40,000/孔，NUGC2 60,000/孔）。 阅读提示：Methods: Cell lines and cell culture; Glutamine starvation/selection experiments |
| shRNA敲低和CRISPR敲除 | shRNA靶序列（mouse Aldh18a1 #1/#2, human ALDH18A1 #1/#2）；筛选浓度（2μg/mL嘌呤霉素）；CRISPR sgRNA靶向外显子16；转染试剂（X-tremeGENE 9, Lipofectamine 3000）。 阅读提示：Methods: shRNA-mediated knockdown of ALDH18A1; CRISPR-mediated knockout of Aldh18a1 |
| 代谢组学分析 | 稳定同位素标记条件（15NH4Cl 0.8mM, 13C5-glutamine 500μM, 13C5-glutamate 5mM）；标记时间（24小时）；细胞密度（6孔板）；LC-MS参数（Zic-pHILIC柱，梯度）；软件（Xcalibur, Compound Discoverer）。 阅读提示：Methods: LC-MS polar metabolomics; Targeted Polar Metabolomics Analysis |
| 体内异种移植 | 小鼠品系（NOD SCID, 年龄和性别）；细胞数量（NUGC2 1×10^6, MKN45 1×10^6, EN 2×10^6）；Matrigel浓度（20%或50%）；肿瘤体积计算（公式）；测量频率（每周两次）；伦理批准编号。 阅读提示：Methods: Xenograft studies |
| 患者样本分析 | 组织类型（胃腺癌和子宫浆液性癌）；切片厚度（5μm）；抗体稀释（P5CS 1:100, GS 1:8000）；染色平台（Aperio Scanscope XT）；分析软件（Halo 3.1）。 阅读提示：Methods: Human Patients’ Histology and immunostaining |