长读长与短读长测序分析结直肠癌转录组
全面解析结直肠癌转录组复杂性，识别新的剪接异构体
对78例CRC肿瘤组织及10例癌旁组织进行ONT长读长测序和Illumina短读长测序，通过FLAIR和SQANTI3等流程进行转录本组装、注释和质控。
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长读长测序揭示结直肠癌异常可变剪接图谱及新型治疗靶点
Long-read sequencing reveals the landscape of aberrant alternative splicing and novel therapeutic target in colorectal cancer
实验完整度
高结合长读长与短读长测序、临床样本验证、体外细胞功能实验、体内小鼠模型以及CRISPR/dCasRx机制验证，证据层级丰富。
主要模型
结直肠癌细胞系（SW480、HCT-8、SW620、LoVo、HCT116、NCM-460） 结直肠癌患者肿瘤及癌旁组织（78对） BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤模型
重点核对
TIMP1 Δ4-5过表达细胞系的构建及效果验证 SRSF1基因敲低对TIMP1剪接的影响 CRISPR/dCasRx系统引导RNA设计及靶向效率 小鼠模型中肿瘤生长抑制效果评估 SW480和HCT-8细胞系迁移和侵袭能力检测
摘要
背景：可变剪接的复杂性在致癌和癌症进展中起着至关重要的作用。对新型剪接事件及其潜在调控机制的更深入理解，可能为制定结直肠癌（CRC）的新型治疗策略提供新的见解。方法：本研究将长读长测序技术与短读长RNA-seq方法相结合，以研究CRC中的转录组复杂性。通过实验分析，我们探索了新鉴定剪接异构体TIMP1 Δ4-5的功能。此外，引入了一种基于CRISPR/dCasRx的策略来诱导TIMP1外显子4-5跳跃，以抑制肿瘤生长。结果：共鉴定出90,703个转录本，其中>62%是相对于当前转录组注释的新转录本。这些新转录本更可能是样本特异性的，表达水平相对较低，外显子更多，并且癌基因在CRC中表现出产生更多转录本的特征。临床结果数据分析显示，1472个差异表达可变剪接事件（DEAS）与CRC患者的预后密切相关，许多新异构体可能是患者生存的重要决定因素。其中，新鉴定的剪接异构体TIMP1 Δ4-5在CRC中显著下调。进一步的体外和体内实验表明，TIMP1 Δ4-5的异位表达可显著抑制肿瘤细胞生长和转移。丝氨酸/精氨酸富集剪接因子1（SRSF1）通过维持TIMP1外显子4-5的包含而充当致癌剪接调节因子。此外，旨在诱导TIMP1外显子4-5跳跃的CRISPR/dCasRx策略具有抑制CRC生长的潜力。结论：这些数据为胃肠道恶性肿瘤的更深入研究提供了丰富的资源。新鉴定的剪接异构体TIMP1 Δ4-5在介导CRC进展中发挥重要作用，可能是CRC的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 结直肠癌中异常可变剪接的图谱如何？新发现的剪接异构体在结直肠癌发生发展中的作用及机制是什么？
- 核心机制
- SRSF1作为致癌剪接调节因子，通过维持TIMP1外显子4-5的包含，促进TIMP1-FL表达，而TIMP1 Δ4-5异构体通过外显子4-5的跳跃产生，抑制肿瘤生长和转移，因此SRSF1通过调控TIMP1剪接促进CRC进展。
- 主要证据
- 在体外和体内实验中，过表达TIMP1 Δ4-5显著抑制细胞生长、迁移和侵袭，并在小鼠模型中抑制肿瘤生长；相反，敲低SRSF1增加TIMP1 Δ4-5表达并抑制细胞增殖、迁移和侵袭，而回补TIMP1 Δ4-5可逆转这些效应。
- 研究意义
- 该研究提供了结直肠癌转录组的丰富资源，揭示了TIMP1 Δ4-5作为潜在治疗靶点，并通过CRISPR/dCasRx策略展示了靶向TIMP1剪接的治疗潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
差异剪接事件鉴定及临床相关性分析
鉴定CRC中差异剪接事件并评估其与预后的关联
使用SUPPA2分析七种类型剪接事件，基于PSI值进行差异分析，并通过单变量Cox回归和Kaplan-Meier分析评估DEAS与总生存期的关联。
TIMP1 Δ4-5异构体的验证和表达分析
验证TIMP1 Δ4-5异构体在CRC中的存在和表达变化
通过Sanger测序、RT-PCR和qRT-PCR在细胞系和组织中验证TIMP1 Δ4-5的存在，并比较其与TIMP1-FL的表达水平。
TIMP1 Δ4-5和TIMP1-FL的功能研究
探究TIMP1 Δ4-5和TIMP1-FL对细胞增殖、迁移、侵袭和肿瘤生长的影响
在CRC细胞中过表达或敲低TIMP1 Δ4-5和TIMP1-FL，通过MTT、集落形成、transwell迁移和侵袭实验检测细胞功能，并采用异种移植模型评估体内肿瘤生长。
SRSF1调控TIMP1外显子4-5剪接的机制研究
阐明SRSF1如何调控TIMP1外显子4-5的包含
通过RBPmap预测剪接因子，利用siRNA敲低候选因子，通过RIP-qPCR验证SRSF1与TIMP1 pre-mRNA结合，通过qRT-PCR和Western blot检测剪接变化。
CRISPR/dCasRx靶向TIMP1剪接的治疗策略
评估基于CRISPR/dCasRx诱导TIMP1外显子4-5跳跃的可行性及抗肿瘤效果
设计靶向TIMP1 pre-mRNA的gRNA，在CRC细胞中验证剪接变化，通过MTT和transwell实验检测细胞功能，并在异种移植模型中评估肿瘤生长抑制效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
差异表达和生存分析
蛋白质编码潜能分析
验证样本或模型特征
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | 凯杰RNeasy小提试剂盒 | Qiagen | -- |
| 长读长测序 | 牛津MinION 1D扩增子文库 | Oxford Nanopore | -- |
| 短读长测序 | Ribo-Zero™磁力试剂盒 | Epicentre Technologies | -- |
| Truseq链特异性RNA测序文库 | Illumina | -- | |
| 测序平台 | Nova-Seq 6000测序平台 | Illumina | -- |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Genom | -- |
| McCoy's 5A培养基 | Genom | -- | |
| F-12K培养基 | Genom | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 逆转录 | 逆转录聚合酶链反应试剂盒 | Vazyme | -- |
| qRT-PCR | SYBR Green荧光染料 | Vazyme | -- |
| LightCycler 480实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| 抗人TIMP1抗体 | Proteintech | 16644-1-AP | |
| 抗人SRSF1抗体 | Proteintech | 12929-2-AP | |
| 抗人β-actin抗体 | Sigma | A5441 | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Thermo Scientific | -- | |
| 质粒构建 | pCS2+载体 | -- | -- |
| siRNA合成 | siSRSF1#1 | GenePharma | -- |
| siSRSF1#2 | GenePharma | -- | |
| siTIMP1 Δ4-5 | GenePharma | -- | |
| 瞬时转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668019 |
| 稳定细胞系构建 | pLVX-Puro慢病毒载体 | -- | -- |
| PolyJet转染试剂 | SignaGen Laboratories | -- | |
| 聚凝胺 | Sigma | -- | |
| 嘌呤霉素 | Thermo Scientific | -- | |
| MTT实验 | MTT试剂 | Sigma | -- |
| 集落形成实验 | 结晶紫 | Sigma | -- |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
| Matrigel基质胶 | -- | -- | |
| 图像采集 | Olympus IX83光学显微镜 | Olympus | -- |
| 基因敲除 | pEP330X载体 | -- | -- |
| RIP-qPCR | 抗SRSF1抗体 | -- | -- |
| 对照IgG抗体 | -- | -- | |
| 蛋白A/G偶联磁珠 | MCE | -- | |
| TRIzol试剂 | Invitrogen | -- | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | GemPharmatech | -- |
| 聚乙烯亚胺 | Sigma-Aldrich | -- | |
| CRISPR/dCasRx | dCasRx质粒 | Addgene | 109050 |
| pXR003-CasRx-gRNA载体 | Addgene | 109053 | |
| BbsI限制性内切酶 | -- | -- | |
| T4连接酶 | -- | -- | |
| 质粒扩增 | DH5α感受态细胞 | Vazyme | -- |
| 蛋白酶K处理 | 蛋白酶K | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（如SW480、HCT-8）、培养基类型、血清和抗生素浓度、培养条件 阅读提示：Methods: Cell culture |
| RNA提取和qRT-PCR | RNA提取试剂盒（如TRIzol）、逆转录试剂盒（Vazyme）、qPCR试剂（SYBR Green）、内参基因、引物序列、循环条件 阅读提示：Methods: RNA isolation, reverse transcription, and qRT-PCR |
| Western blot | 裂解液成分、抗体名称及稀释比例、二抗及检测条件 阅读提示：Methods: Western blotting |
| 细胞增殖和功能实验 | 细胞接种密度、处理时间、MTT浓度、结晶紫浓度、transwell小室孔径、基质胶浓度、孵育时间 阅读提示：Methods: Cell proliferation, Cell migration and invasion |
| 动物实验 | 小鼠品系、周龄、性别、数量、细胞接种数量、给药途径和剂量、测量时间点 阅读提示：Methods: Animal models |
| SRSF1敲低和功能实验 | siRNA序列、转染试剂和浓度、敲低效率验证、功能实验条件 阅读提示：Methods: Plasmids, siRNAs, and transfection |
| CRISPR/dCasRx靶向实验 | dCasRx质粒来源和突变位点、gRNA序列和克隆方法、转染条件和时间、剪接检测方法 阅读提示：Methods: Targeting TIMP1 AS by using dCasRx system |