建立人扁桃体单细胞3D基因组与转录组图谱
绘制人扁桃体不同细胞类型的3D基因组组织和基因表达，识别B细胞发育轨迹中的染色质结构变化。
整合Droplet Hi-C和MINA（染色质追踪、RNA MERFISH、smFISH和蛋白质染色）分析人扁桃体组织，获得单细胞3D基因组和转录组数据，并进行细胞分型和3D基因组特征量化。
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人类扁桃体的3D基因组图谱及环挤压在B细胞体细胞超突变中的作用
A 3D genome atlas of human tonsil and the role of loop extrusion in B cell somatic hypermutation.
实验完整度
高包含原代扁桃体组织多组学图谱、B细胞淋巴瘤细胞系、RAD21降解功能验证及机制链路的多层级证据。
主要模型
人扁桃体组织原代样本 Ramos B细胞淋巴瘤细胞系 TMD8弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系 RAD21-degron RASH-1C细胞系
重点核对
RAD21-degron RASH-1C细胞中dTAGV-1处理6小时降解RAD21，随后Dox诱导AID表达14小时，检测GFP报告基因、IGH-V和IGL-V突变频率 RAD21降解后不同时间点（2、6、12、18、24小时）通过染色质追踪和3C-HTGTS检测IGH/IGL位点三维相互作用变化 RAD21降解后6小时和18小时通过CUT&RUN检测AID在Ig和非Ig位点的结合变化 Droplet Hi-C分析使用来自2名供体的4个扁桃体组织生物学重复，获得12,308个高质量单细胞 MINA成像使用来自3名供体的5个生物学重复，染色质追踪靶向1,151个基因组位点，RNA MERFISH靶向447个RNA种类
摘要
生发中心组织微环境中的B细胞成熟涉及通过体细胞超突变（SHM）实现免疫球蛋白基因多样化。三维（3D）基因组结构如何影响SHM尚不完全清楚。我们利用基于测序和基于成像的3D基因组学及转录组学，绘制了人类扁桃体和B细胞淋巴瘤细胞系中不同细胞类型和状态的单细胞3D基因组组织和基因表达图谱。这些分析揭示了B细胞免疫应答和SHM激活过程中区室、环化和核位置变化的轨迹。靶向蛋白降解黏连蛋白组分RAD21，揭示了其对实现SHM的贡献。我们的结果提供了人类扁桃体细胞的单细胞3D基因组图谱，并勾勒出染色质环挤压机器与SHM之间的联系。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 三维基因组结构如何影响B细胞体细胞超突变（SHM）的靶向和 Mistargeting，以及黏连蛋白在其中的作用是什么？
- 核心机制
- 黏连蛋白组分RAD21通过维持染色质三维结构、转录环境和AID在靶位点的持续招募来支持SHM；冷TADs倾向于在核内聚集且靠近核内部，可能保护其免受SHM。
- 主要证据
- 整合Droplet Hi-C和MINA成像绘制人扁桃体单细胞3D基因组图谱，发现冷TADs在DZ和LZ B细胞中空间聚集且径向评分较低；RAD21降解导致SHM几乎完全丧失，同时伴随染色质环化、转录和AID结合下降。
- 研究意义
- 提供了人类扁桃体细胞的单细胞3D基因组图谱，并建立了染色质环挤压机器与SHM之间的联系，有助于理解核组织在健康与疾病平衡中的作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析SHM易感性与3D基因组结构关联
验证热TAD和冷TAD在细胞核中的空间分布差异及其与SHM易感性的关系。
在MINA数据中计算热TAD、冷TAD和填充位点之间的归一化空间距离和径向评分，比较不同细胞类型中的分布差异。
构建RAD21降解细胞系并验证SHM功能
通过急性降解RAD21检测黏连蛋白功能缺失对SHM的影响。
在RASH-1C细胞系中构建RAD21-degron标签，使用dTAGV-1降解RAD21，通过Mut-Seq检测GFP报告基因、IGH-V和IGL-V的突变频率，并检测AID蛋白表达、细胞周期和细胞活力。
解析RAD21缺失对染色质结构、转录和AID结合的影响
探究RAD21降解后SHM受损的分子机制，包括染色质环化、转录和AID招募的变化。
通过染色质追踪和3C-HTGTS检测IGH和IGL位点三维相互作用；通过CUT&RUN检测Pol II、磷酸化Pol II和AID的结合；通过TT-TimeLapse-seq检测新生转录。
鉴定IGH 3'RR超级增强子区域的“卷曲”结构
探究IGH位点对RAD21缺失具有抵抗性的结构基础。
通过染色质追踪空间距离矩阵、Hi-C接触矩阵和3C-HTGTS分析3'RR1和3'RR2的平行排列构象，并使用高严格性探针库验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织切片制备 | 40毫米盖玻片 | Bioptech | 40-1313-0319 |
| 免疫荧光 | CD35抗体 | Invitrogen | A51014 |
| 细胞膜染色 | 小麦胚芽凝集素 | biotium | 29026 |
| 细胞核染色 | DAPI | Thermo Fisher | 62248 |
| CUT&RUN | CUTANA ChIC/CUT&RUN试剂盒 | Epicypher | 14-1048 |
| RAD21抗体 | Abcam | ab992 | |
| HA抗体 | Santa Cruz | sc-7392 | |
| Rpb1 CTD抗体 | Cell Signaling Technology | 2629 | |
| S2P-RNAPII抗体 | Cell Signaling Technology | 13499 | |
| S5P-RNAPII抗体 | Cell Signaling Technology | 13523 | |
| H3K27ac抗体 | Abcam | ab4729 | |
| AID抗体 | Invitrogen | 39-2500 | |
| RAD21降解 | dTAGV-1 | Tocris | 6914 |
| RAD21降解对照 | NEG对照化合物 | Tocris | 6915 |
| AID诱导 | 多西环素 | Sigma-Aldrich | D3447 |
| TT-TimeLapse-seq | 4-硫代尿苷 | Fisher Scientific | 13957-31-8 |
| Droplet Hi-C | DpnII限制酶 | NEB | R0543L |
| MboI限制酶 | NEB | R0147M | |
| NlaIII限制酶 | NEB | R0125L | |
| 3C-HTGTS | NlaIII限制酶 | NEB | R0125 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人扁桃体Droplet Hi-C | 组织来源与伦理审批（Yale Human Investigation Committee protocol no. 0304025173）；单细胞解离方法；4个生物学重复来自2名供体；12,308个高质量细胞 阅读提示：Materials and Methods中“Droplet Hi-C in human tonsil”小节及“Human material”小节 |
| MINA成像 | 组织切片厚度8 μm；染色质追踪探针库靶向1,151个位点；RNA MERFISH靶向447个RNA种类；smFISH靶向9个RNA种类；5个生物学重复来自3名供体 阅读提示：Materials and Methods中“MINA experiments in human tonsil”小节及“Probe design and synthesis”小节 |
| RAD21降解与SHM检测 | dTAGV-1浓度0.5 μM；Dox浓度200 ng/mL；降解时间6小时，AID诱导14小时；突变检测位点GFP7报告基因HTS7区域、IGH-V和IGL-V 阅读提示：Materials and Methods中“CUT&RUN”小节及“High-throughput mutation-sequencing”小节；Fig. 4D、4E图注 |
| 染色质追踪与3C-HTGTS | IGH追踪库覆盖48个10-kb片段（chr14:105,496,000–105,976,000）；IGL追踪库覆盖25个10-kb片段（chr22:22,657,531–22,907,531）；3C-HTGTS诱饵位点位置；RAD21降解时间点2、6、12、18、24小时 阅读提示：Materials and Methods中“In the fine scale chromatin tracing library design”小节及“3C-HTGTS”小节；Fig. 4G–J图注 |
| AID CUT&RUN | AID抗体（Invitrogen 39-2500）；RAD21降解6小时和18小时时间点；Dox诱导条件；Ig和非Ig位点分析 阅读提示：Materials and Methods中“CUT&RUN”小节；Fig. 5F–L图注 |