人端粒酶二聚体的冷冻电镜结构揭示H/ACA RNP介导的二聚化

Cryo-EM structure of human telomerase dimer reveals H/ACA RNP-mediated dimerization.

作者信息Sebastian Balch, Zala Sekne, Elsa Franco-Echevarría, Patryk Ludzia, Rachael C Kretsch, Wenqing Sun, Haopeng Yu, George E Ghanim, Sigurdur Thorkelsson, Yiliang Ding, Rhiju Das, Thi Hoang Duong Nguyen

PMID40638752

期刊Science

发布时间2025-07-10

DOI10.1126/science.adr5817

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实验完整度

高

冷冻电镜结构解析、体外生化验证、细胞实验及突变功能验证多层级证据

主要模型

Expi293F细胞中重组表达的人端粒酶 HEK293T细胞 split nano-luciferase 实验 HCT116 hTR敲除细胞端粒长度救援实验

重点核对

双标签TERT共纯化检测二聚体形成 P4.2 switch和P4.2 comp. hTR突变体对二聚体形成的影响 P4.2 switch突变体在HCT116 hTR KO细胞中的端粒长度救援 dyskerin和NHP2二聚化界面突变体与内源蛋白竞争组装催化失活TERT突变体D712A/D868A/D869A用于检测催化核心协同性

摘要

端粒酶核糖核蛋白（RNP）利用端粒酶逆转录酶（TERT）和端粒酶RNA（人类为hTR）在染色体末端合成端粒重复序列。先前结构工作显示人端粒酶通常为单体，含单拷贝TERT和hTR。虽有二聚体复合物的证据，但其组成、高分辨率结构和功能仍不清楚。在此，我们报道了结合端粒DNA的人端粒酶二聚体的冷冻电镜结构。该结构揭示了一个26亚基组装体和二聚化界面，早衰疾病突变定位于此。破坏二聚体形成会影响RNP组装、总体端粒酶活性和细胞中的端粒维持。我们的发现解决了围绕端粒酶二聚体的长期谜团，并提示二聚体在端粒酶组装中的作用。

冷冻电镜数据采集与二聚体颗粒富集

从人端粒酶样品中鉴定并富集二聚体颗粒以解析其结构。

在含TPT和端粒DNA的人端粒酶样品中收集冷冻电镜数据，通过二维分类发现少量二聚体颗粒，整合四套独立数据集富集二聚体颗粒，获得6.2 Å共识图。

双标签共纯化验证二聚体存在

生化验证含两个TERT拷贝的端粒酶RNP的存在。

用ZZ-F-TERT和ZZ-SS-TERT共转染Expi293F细胞，经寡核苷酸亲和纯化和Strep-Tactin pulldown，免疫印迹检测Flag标签TERT共纯化。

split nano-luciferase检测细胞内二聚体形成

检测细胞内两个TERT分子是否近距离形成复合物。

HEK293T细胞共转染hTR和携带LgBiT或SmBiT的TERT构建体，检测生物发光。

冷冻电镜结构解析二聚体组成和二聚化界面

解析二聚体整体架构、亚基组成及H/ACA RNP介导的二聚化界面。

对二聚体颗粒进行信号减除和聚焦分类，获得单个H/ACA RNP protomer 3.0 Å图和H/ACA RNP二聚体3.9 Å图，并结合已发表模型和DRRAFTER建模构建完整原子模型。

体外端粒酶活性检测二聚体催化活性

验证纯化的双标签二聚体是否具有延伸端粒DNA的活性。

对纯化的双标签二聚体进行端粒酶引物延伸活性 assay。

P4.2茎突变破坏二聚化并影响端粒维持

验证hTR P4.2茎对二聚体形成的重要性及其对细胞端粒维持的影响。

构建P4.2 switch、P4.2 comp.等hTR突变体，用双标签共纯化检测二聚体形成；在HCT116 hTR KO细胞中表达WT或突变hTR，进行TRF assay检测端粒长度。

H/ACA蛋白二聚化界面突变影响端粒酶组装

验证二聚化界面上的H/ACA蛋白残基对端粒酶组装的功能重要性。

将WT或突变3xFlag-dyskerin或3xFlag-NHP2与ZZ-SS-TERT和hTR共转染，经寡核苷酸纯化后免疫印迹比较过表达蛋白与内源蛋白的组装竞争效率。

检测两个催化核心的独立性与DNA结合

确定二聚体中两个催化核心是否同时结合DNA以及是否存在协同性。

对两个催化核心分别进行信号减除和聚焦分类，解析各自DNA结合状态；纯化含一个WT TERT和一个催化失活TERT的杂合二聚体，比较活性；甘油梯度离心分离单体和二聚体，比较活性与持续合成能力。

实验环节	名称	品牌	货号
细胞培养	Expi293F细胞	ThermoFisher	A14527
HEK293T细胞	ATCC	CRL-3216
质粒构建	NEB Q5定点突变试剂盒	NEB	E0554
质粒制备	PureLink HiPure质粒中提试剂盒	Invitrogen	K210005
蛋白纯化	链霉亲和素琼脂糖树脂	Thermo Scientific	20361
MagStrepXT树脂	IBA LifeSciences	2-4090-002
DYKDDDK Fab-Trap琼脂糖树脂	Chromotek	ffa
SUMOstar蛋白酶	LifeSensors	SP4110
端粒酶活性实验	α-32P-dGTP	Hartmann Analytic Gmbh	FP204
dGpCpp	Jena Bioscience	NU-431S
split nano-luciferase实验	Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000001
Nano-Glo活细胞试剂	Promega	N2011
Glomax Discover酶标仪	Promega	GM3000
免疫印迹	抗Flag抗体	Proteintech	66008-4-Ig
抗TERT抗体	Abcam	32020
兔抗dyskerin抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-48794
兔抗NHP2抗体	Proteintech	15128-1-AP
冷冻电镜样品制备	BS3交联剂	ThermoFisher	A39266
C-flat-T-50 4/2载网	Protochips	CF-4/2-4Cu-T-50
DMS化学探测	RNA清洁浓缩试剂盒	Zymo Research	R1016
SuperScript II逆转录酶	ThermoFisher	18064014

实验环节

名称

品牌

货号

细胞培养

Expi293F细胞

ThermoFisher

A14527

HEK293T细胞

ATCC

CRL-3216

质粒构建

NEB Q5定点突变试剂盒

NEB

E0554

质粒制备

PureLink HiPure质粒中提试剂盒

Invitrogen

K210005

蛋白纯化

链霉亲和素琼脂糖树脂

Thermo Scientific

20361

MagStrepXT树脂

IBA LifeSciences

2-4090-002

DYKDDDK Fab-Trap琼脂糖树脂

Chromotek

ffa

SUMOstar蛋白酶

LifeSensors

SP4110

端粒酶活性实验

α-32P-dGTP

Hartmann Analytic Gmbh

FP204

dGpCpp

Jena Bioscience

NU-431S

split nano-luciferase实验

Lipofectamine 3000

ThermoFisher

L3000001

Nano-Glo活细胞试剂

Promega

N2011

Glomax Discover酶标仪

Promega

GM3000

免疫印迹

抗Flag抗体

Proteintech

66008-4-Ig

抗TERT抗体

Abcam

32020

兔抗dyskerin抗体

Santa Cruz Biotechnology

sc-48794

兔抗NHP2抗体

Proteintech

15128-1-AP

冷冻电镜样品制备

BS3交联剂

ThermoFisher

A39266

C-flat-T-50 4/2载网

Protochips

CF-4/2-4Cu-T-50

DMS化学探测

RNA清洁浓缩试剂盒

Zymo Research

R1016

SuperScript II逆转录酶

ThermoFisher

18064014

环节	核对要点
双标签端粒酶纯化	输入裂解液体积与细胞悬浮液体积比例：WT二聚体为168 mL/1 L；ΔPAL二聚体为168 mL/1.2 L；杂合二聚体为196 mL/1.5 L 阅读提示：Materials and methods中Expression and purification of the dual-tagged telomerase小节及fig. S5A、S10E、S11A
冷冻电镜数据采集	总电子剂量约48 e-/Å²、曝光时间2.5秒、像素尺寸1.059 Å、defocus范围-0.8至2.4 μm、四套数据集共66,992个movie 阅读提示：Materials and methods中Cryo-EM sample preparation and data collection小节
端粒酶活性实验	反应温度30 °C、时间45分钟、α-32P-dGTP浓度0.1 μM、引物(TTAGGG)5浓度500 nM 阅读提示：Materials and methods中Telomerase activity assays小节
HCT116 hTR KO细胞端粒长度救援	慢病毒转导后hygromycin B筛选浓度300 μg/mL筛选7天；TRF assay使用3-10 μg基因组DNA 阅读提示：Materials and methods中Lentivirus transduction of HCT116 hTR knockout (KO) cells和Telomere restriction fragment assay小节；Fig. 4C
DMS化学探测	DMS终浓度1%、37 °C反应5分钟、DTT终浓度0.5 M淬灭；两个独立生物学重复阅读提示：Materials and methods中DMS chemical probing and data analysis小节；fig. S15E

环节

核对要点

双标签端粒酶纯化

输入裂解液体积与细胞悬浮液体积比例：WT二聚体为168 mL/1 L；ΔPAL二聚体为168 mL/1.2 L；杂合二聚体为196 mL/1.5 L

阅读提示：Materials and methods中Expression and purification of the dual-tagged telomerase小节及fig. S5A、S10E、S11A

冷冻电镜数据采集

总电子剂量约48 e-/Å²、曝光时间2.5秒、像素尺寸1.059 Å、defocus范围-0.8至2.4 μm、四套数据集共66,992个movie

阅读提示：Materials and methods中Cryo-EM sample preparation and data collection小节

端粒酶活性实验

反应温度30 °C、时间45分钟、α-32P-dGTP浓度0.1 μM、引物(TTAGGG)5浓度500 nM

阅读提示：Materials and methods中Telomerase activity assays小节

HCT116 hTR KO细胞端粒长度救援

慢病毒转导后hygromycin B筛选浓度300 μg/mL筛选7天；TRF assay使用3-10 μg基因组DNA

阅读提示：Materials and methods中Lentivirus transduction of HCT116 hTR knockout (KO) cells和Telomere restriction fragment assay小节；Fig. 4C

DMS化学探测

DMS终浓度1%、37 °C反应5分钟、DTT终浓度0.5 M淬灭；两个独立生物学重复

阅读提示：Materials and methods中DMS chemical probing and data analysis小节；fig. S15E

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