建立KRASi耐药模型并检测蛋白质稳态
明确致癌KRAS抑制对蛋白质稳态的影响及耐药后的恢复。
使用Dox诱导KrasG12D的iKras细胞、iKras GEMM、KRASG12C突变细胞系及异种移植瘤，通过PROTEOSTAT、Congo red、ThT和K48泛素化检测蛋白聚集。
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蛋白质稳态网络的调控促进肿瘤对致癌KRAS抑制剂的耐药
Modulation of the proteostasis network promotes tumor resistance to oncogenic KRAS inhibitors.
实验完整度
高包含体外细胞系、基因工程小鼠模型、异种移植和PDX模型，并有磷酸化位点突变、激酶/磷酸酶实验等功能与机制验证
主要模型
iKras小鼠PDAC细胞（Dox诱导KrasG12D） MIA-PaCa-2和H358人癌细胞系及其sotorasib耐药株 iKras GEMM和MIA-PaCa-2/H358异种移植瘤 KRAS突变PDAC和NSCLC PDX模型
重点核对
iKras细胞Dox撤除后30天获得耐药（iKrasR），需持续撤除Dox维持耐药 sotorasib耐药株经递增剂量sotorasib长期培养获得，维持耐药需持续给药 IRE1α磷酸化位点S525、S529、S549、T973的4A和SDTE突变体功能验证 体内药物剂量：sotorasib 30/50/100 mg/kg，trametinib 1 mg/kg，ORIN1001 150/300 mg/kg PDX模型来源及给药方案：SCID/beige或NSG小鼠，肿瘤体积50–500 mm3后随机分组
摘要
尽管靶向突变KRAS取得了显著进展，但肿瘤对KRAS抑制剂（KRASi）的耐药仍是主要障碍。在此，我们报道蛋白质稳态重编程是多种KRASi耐药机制的关键汇聚点。致癌KRAS失活下调热休克反应和未折叠蛋白反应的IRE1α分支，导致严重的蛋白质稳态紊乱。然而，在获得性KRASi耐药肿瘤中，IRE1α以不依赖ER应激的方式被选择性重新激活，恢复蛋白质稳态。致癌KRAS通过ERK依赖的IRE1α磷酸化促进IRE1α蛋白稳定性，导致IRE1α与HRD1 E3连接酶解离。在KRASi耐药肿瘤中，重新激活的ERK和过度激活的AKT均恢复IRE1α磷酸化和稳定性。抑制IRE1α可克服对KRASi的耐药。本研究揭示了一种导致蛋白质稳态重编程并促进KRASi耐药的可成药机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 致癌KRAS如何调控蛋白质稳态网络，以及KRASi耐药肿瘤如何重编程蛋白质稳态以绕过KRAS依赖。
- 核心机制
- 致癌KRAS通过ERK依赖的IRE1α磷酸化（S525、S529、S549、T973）阻止SEL1L/HRD1介导的IRE1α泛素化降解；KRASi耐药肿瘤中重新激活的ERK和过度激活的AKT汇聚于相同位点恢复IRE1α稳定性，重建蛋白质稳态。
- 主要证据
- iKras细胞、MIA-PaCa-2和H358耐药细胞、GEMM及异种移植瘤中IRE1α水平变化；IRE1α磷酸化位点突变体的激酶实验、泛素化和降解实验；体内IRE1α抑制剂ORIN1001联合sotorasib或trametinib增强疗效。
- 研究意义
- 揭示致癌信号与蛋白质质量控制机器的直接交叉对话，提出IRE1α介导的蛋白质稳态重编程是多种KRASi耐药机制的汇聚点，直接靶向IRE1α是逆转KRASi或MEKi耐药的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
解析蛋白质稳态调控网络的关键节点
确定KRAS抑制后哪些应激通路发生变化及耐药时哪些被恢复。
免疫印迹检测IRE1α/XBP1、ATF6、PERK、GCN2/eIF2α/ATF4和HSF1磷酸化及靶基因，结合基因敲除和荧光素酶报告。
验证IRE1α/XBP1对耐药细胞蛋白质稳态的必要性
确定IRE1α/XBP1是否维持KRASi耐药细胞的蛋白质稳态和存活。
在iKrasP和iKrasR细胞中敲低Ire1α或Xbp1，检测蛋白聚集和细胞生长，并用TUDCA rescue及催化死突变体验证。
阐明MAPK调控IRE1α稳定性的机制
确定致癌KRAS通过何种通路调控IRE1α蛋白水平。
使用MEK/ERK和PI3K/AKT抑制剂处理细胞，检测IRE1α水平；结合MG132、SEL1L敲低、p97抑制剂和免疫共沉淀分析泛素化降解。
鉴定ERK对IRE1α的直接磷酸化及功能位点
验证ERK直接结合并磷酸化IRE1α，鉴定磷酸化位点及其对稳定性的影响。
GST pull-down、体外激酶实验、质谱和位点突变（4A、SDTE）分析IRE1α磷酸化及其与HRD1/SEL1L的相互作用。
揭示耐药肿瘤中IRE1α再激活的多通路汇聚机制
确定KRASi耐药细胞中IRE1α恢复的上游信号和磷酸化调控。
检测耐药细胞中ERK和AKT活性，联合抑制ERK和AKT，表达MEKDD、PIK3CAH1047R或myr-AKT，并鉴定SCP3磷酸酶。
评估IRE1α抑制剂联合KRASi或MEKi的体内疗效
验证靶向IRE1α能否克服KRASi或MEKi耐药。
在iKras、MIA-PaCa-2、H358异种移植瘤及多个PDX模型中，联合使用ORIN1001与sotorasib或trametinib，监测肿瘤体积、生存和蛋白聚集。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白聚集检测 | PROTEOSTAT蛋白聚集体检测试剂盒 | Enzo Life Sciences | ENZ-51035-K100 |
| 刚果红染料 | Sigma | 234610 | |
| 硫黄素T染料 | Sigma | T3516 | |
| 细胞培养 | BEBM支气管上皮细胞生长基础培养基 | Lonza | CC-3171 |
| BEGM支气管上皮细胞生长因子添加剂套装 | Lonza | CC-4175 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10437028 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140163 | |
| 多西环素 | VWR | AAJ60579–22 | |
| 活性炭处理胎牛血清 | VWR | 97065–304 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8细胞活力检测试剂盒 | APExBIO | K1018 |
| BrdU掺入实验 | BrdU染色试剂盒 | BD Biosciences | 559619 |
| 荧光素酶实验 | pGL3基本荧光素酶报告载体 | Promega | E1751 |
| pRL-TK海肾荧光素酶质粒 | Promega | E2241 | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher | L300008 | |
| 蛋白酶体活性检测 | 蛋白酶体活性荧光检测试剂盒 | BioVision | K245 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| 质粒构建 | Q5定点突变试剂盒 | New England Biolabs | E0554 |
| 病毒包装与感染 | 聚凝胺 | Millipore Sigma | TR-1003-G |
| 嘌呤霉素 | Millipore Sigma | P8833 | |
| 免疫组化 | IRE1α抗体 | Cell Signaling Technology | 3294 |
| 磷酸化ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4376 | |
| 磷酸化HSF1抗体 | Life Technologies | BSM-52166R | |
| 磷酸化PERK抗体 | Cell Signaling Technology | 3179 | |
| ATF4抗体 | Santa Cruz | 390063 | |
| 磷酸化GCN2抗体 | Thermo Fisher | PA5–105886 | |
| 磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 磷酸化eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | 9721 | |
| YAP1抗体 | Cell Signaling Technology | 14074 | |
| ImmPRESS Excel HRP山羊抗兔聚合物试剂 | Vector labs | MP-7451–15 | |
| DAB+显色液 | Dako | K3468 | |
| RNA提取与RT-qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 |
| 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368813 | |
| 蛋白聚集检测 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 14826500 |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Sigma | 4906845001 | |
| N-乙基马来酰亚胺 | Sigma | E3876 | |
| 免疫共沉淀 | 抗Flag M2磁珠 | Sigma | F-2426 |
| 抗Myc磁珠 | Sigma | E-6654 | |
| GST pull-down | GST-ERK2蛋白 | SignalChem | M28–10G-20 |
| 谷胱甘肽琼脂糖珠 | GE Healthcare | 17075601 | |
| 体外激酶实验 | 激酶实验缓冲液I | SignalChem | K01–09 |
| [γ-32P] ATP | PerkinElmer | NEG002A100UC | |
| 镍-氮川三乙酸琼脂糖 | QIAGEN | 30210 | |
| 体外磷酸酶实验 | 重组His-SCP3蛋白 | NOVUS | NBP1–99109 |
| 磷酸化RTK芯片 | Proteome Profiler人磷酸化RTK芯片试剂盒 | R&D systems | ARY001B |
| Western blot | 硝酸纤维素膜 | Biorad | 1620112 |
| 动物实验 | 基质胶 | Corning | #354230 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| KRASi耐药模型建立 | iKrasR细胞撤除Dox持续时间、sotorasib耐药株诱导浓度和周期、耐药维持需持续给药 阅读提示：Methods中Cell culture and treatment及图S1、S2图注 |
| 体内药物处理 | sotorasib 30/50/100 mg/kg、trametinib 1 mg/kg、ORIN1001 150/300 mg/kg的给药途径和周期 阅读提示：Methods中Tumor inoculation and treatment及各图图注 |
| IRE1α磷酸化位点功能验证 | S525、S529、S549、T973的4A和SDTE突变体构建及激酶实验条件 阅读提示：Methods中In vitro kinase assay及图4、图S8–S10图注 |
| 蛋白聚集检测 | PROTEOSTAT染料稀释比例、MG132阳性对照浓度和处理时间、Congo red和ThT浓度 阅读提示：Methods中Protein aggregation detection assay |