建立初免与鼻内刺突加强免疫方案
验证无佐剂鼻内刺突加强能否在既往mRNA-LNP初免基础上诱导黏膜免疫。
K18-hACE2小鼠经IM接种mRNA-LNP（BNT162b2）初免，14天后经IN给予无佐剂预融合稳定三聚体刺突蛋白，检测鼻洗液、BALF和血清抗体及肺组织B细胞。
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无佐剂鼻内刺突疫苗引发针对沙贝病毒的保护性黏膜免疫
Unadjuvanted intranasal spike vaccine elicits protective mucosal immunity against sarbecoviruses.
实验完整度
高包含体外抗体/中和检测、小鼠与仓鼠两种动物模型、致死性攻击保护、免疫细胞分析与传播模型，具备功能与机制验证
主要模型
K18-hACE2小鼠 叙利亚仓鼠 Vero E6过表达ACE2和TMPRSS2细胞
重点核对
K18-hACE2小鼠经IM接种1 μg或0.05 μg mRNA-LNP（BNT162b2）初免，14天后IN给予1 μg无佐剂刺突蛋白加强 仓鼠经IM接种0.5 μg mRNA-LNP初免，21天后IN给予5 μg刺突蛋白加强 小鼠攻击剂量为6×10^4 PFU SARS-CoV-2（2019n-CoV/USA_WA1/2020），仓鼠为6×10^3 PFU 小鼠攻击时间为初免后118天（部分实验）或加强后6周，观察14天体重与生存 对照分组包括naïve、IM初免单独、IN刺突单独及P&S，数据合并自两或三次独立实验
摘要
严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）大流行凸显了不仅需要预防疾病、还需阻断传播的疫苗。胃肠外疫苗可诱导强效全身免疫，但呼吸道黏膜免疫较差。我们开发了一种称为“初免与刺突”（prime and spike）的疫苗策略，利用初次接种（初免）产生的既存免疫，通过使用无佐剂鼻内刺突加强免疫（spike）在呼吸道内引发黏膜免疫记忆。我们证明，初免与刺突可诱导强效的组织驻留记忆B细胞和T细胞应答，在呼吸道黏膜诱导免疫球蛋白A，增强全身免疫，并使具有部分免疫的小鼠完全免受致死性SARS-CoV-2感染。使用分歧的刺突蛋白，初免与刺突能够诱导针对沙贝病毒的交叉反应性免疫。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否利用既往全身初免产生的免疫，通过无佐剂鼻内刺突加强免疫诱导呼吸道黏膜免疫，从而预防SARS-CoV-2感染与传播？
- 核心机制
- P&S将初免产生的全身免疫转化为呼吸道局部黏膜免疫记忆，诱导抗原特异性CD8+ TRM、CD4+ TRM、BRM细胞及黏膜IgA和IgG，从而在呼吸道形成保护屏障。
- 主要证据
- K18-hACE2小鼠和叙利亚仓鼠模型中，P&S诱导肺、BALF和鼻甲的组织驻留记忆B、T细胞及黏膜IgA/IgG；低剂量初免小鼠经P&S后完全免于致死性攻击的体重下降和死亡，并降低上下呼吸道病毒载量；仓鼠模型中P&S较mRNA-LNP初免-加强更有效阻断传播；使用SARS-CoV-1刺突异源加强可诱导交叉反应免疫。
- 研究意义
- 文献提出，通过疫苗接种增强黏膜免疫有望在变异株不断出现时提升保护并减缓传播，可能成为应对其他呼吸道病原体和下一次大流行的重要工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测黏膜与全身抗体及中和应答
评估P&S是否诱导黏膜IgA/IgG及全身抗体和中和能力。
检测鼻洗液、BALF和血清中SARS-CoV-2刺突S1特异性IgA和IgG，并用刺突假型化VSV检测BALF和血清中和滴度。
分析肺组织驻留记忆B细胞和T细胞
验证P&S是否在肺组织建立抗原特异性驻留记忆B细胞和T细胞。
采用静脉CD45标记区分血管内与血管外细胞，结合RBD四聚体和MHC四聚体，流式检测肺组织BRM、ASC、CD8+ TRM和CD4+ TRM。
评估致死性SARS-CoV-2攻击保护
验证P&S能否保护部分免疫小鼠免受致死性感染和肺病理。
低剂量mRNA-LNP初免小鼠经IN刺突或PACE-spike加强，6周后以SARS-CoV-2攻击，监测体重、生存、病毒滴度和肺组织病理。
比较P&S与IM mRNA-LNP加强的免疫与保护
比较P&S与现行胃肠外mRNA-LNP加强方案的黏膜免疫、全身免疫和保护效果。
小鼠经IM mRNA-LNP初免后分别接受IM mRNA-LNP加强或IN刺突加强，检测肺TRM、BALF和血清抗体、中和滴度，并在初免后118天攻击。
仓鼠模型评估传播阻断
验证P&S在仓鼠模型中的保护效果及对病毒传播的阻断能力。
叙利亚仓鼠经IM mRNA-LNP初免后接受IM mRNA-LNP加强或IN刺突加强，感染后检测口咽拭子病毒滴度，并与感染供体仓鼠共居评估传播。
异源SARS-CoV-1刺突加强评估交叉免疫
验证使用分歧刺突蛋白进行鼻内加强能否诱导针对沙贝病毒的交叉反应免疫。
SARS-CoV-2 mRNA-LNP初免小鼠经IN给予SARS-CoV-1刺突加强，检测针对SARS-CoV-1和SARS-CoV-2的T细胞、黏膜和全身抗体及中和滴度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 初免疫苗接种 | Comirnaty（BNT162b2）mRNA-LNP疫苗 | Pfizer/BioNTech | -- |
| 鼻内加强免疫 | SARS-CoV-2稳定化刺突蛋白 | ACRO biosystems | SPN-C52H9 |
| SARS-CoV-1刺突蛋白 | ACRO biosystems | SPN-S52H6 | |
| ELISA包被 | 重组SARS-CoV-2 S1蛋白 | ACRO Biosystems | S1N-C52H3 |
| 重组SARS-CoV-1 S1蛋白 | ACRO Biosystems | S1N-S52H5 | |
| ELISA二抗 | HRP标记抗小鼠IgG | Cell Signaling Technology | 7076 |
| HRP标记抗小鼠IgA | Southern Biotech | 1040-05 | |
| HRP标记抗仓鼠IgG | Southern Biotech | 6060-05 | |
| 兔抗仓鼠IgA HRP | Brookwood Biomedical | sab3003a | |
| ELISA显色 | TMB底物试剂盒 | BD Biosciences | 555214 |
| ELISA板 | MaxiSorp板 | Thermo Scientific | 442404 |
| mRNA提取 | TRIzol LS试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNeasy Maxi试剂盒 | Qiagen | -- | |
| mRNA纯度检测 | NanoDrop 8000分光光度计 | ThermoFisher | ND-8000-GL |
| 凝胶电泳 | SYBR Safe染料 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 流式细胞术 | 可固定Aqua细胞活力染料 | Invitrogen | L34957 |
| 抗小鼠CD16/CD32 Fc封闭剂 | BD Biosciences | 553141 | |
| 蛋白转运抑制剂混合物 | eBioscience | 00-4980-03 | |
| 透化缓冲液 | eBioscience | 00-8333-56 | |
| Fc封闭剂 | BioXCell | BE0307 | |
| B细胞四聚体制备 | 重组SARS-CoV-2刺突RBD His生物素蛋白 | R&D | BT10500-050 |
| 链霉亲和素-PE | Prozyme | PJRS25 | |
| 链霉亲和素-APC | Prozyme | PJ27S | |
| 假病毒中和实验 | Renilla-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | -- |
| 被动裂解缓冲液 | Promega | -- | |
| 假病毒中和检测 | SpectraMax i3酶标仪 | Molecular Devices | -- |
| 病毒滴度检测 | PurFlock Ultra口咽拭子 | Pruitan | 25-3206-U |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 初免与鼻内刺突加强免疫 | 小鼠品系（K18-hACE2）、初免剂量（IM 1 μg或0.05 μg mRNA-LNP）、加强剂量（IN 1 μg刺突）、加强间隔（14天或84天） 阅读提示：Materials and methods的Vaccination小节及Fig. 1A图注 |
| PACE-spike鼻内加强 | PACE与mRNA重量比（50:1）、加强剂量（10 μg mRNA）、初免后加强时间（14天） 阅读提示：Materials and methods的PACE polyplex formulation and characterization小节及Fig. 3I图注 |
| SARS-CoV-2攻击实验 | 攻击毒株（2019n-CoV/USA_WA1/2020）、攻击剂量（小鼠6×10^4 PFU；仓鼠6×10^3 PFU）、攻击时间（加强后6周或初免后118天）、观察终点 阅读提示：Materials and methods的SARS-CoV-2 infection小节及Fig. 3A、Fig. 4A、Fig. 5A图注 |
| 黏膜与全身抗体检测 | 样本类型（鼻洗液、BALF、血清）、起始稀释度（血清1:50或1:40；BALF 1:4）、二抗稀释比例 阅读提示：Materials and methods的SARS-CoV-2–specific antibody measurements小节 |
| 组织驻留记忆细胞流式分析 | IV CD45标记剂量（2 μg）、组织消化条件（胶原酶A和DNase I，37°C 45分钟）、四聚体染色条件 阅读提示：Materials and methods的Intravascular labeling, cell isolation, and flow cytometry小节及fig. S10 |
| 仓鼠传播实验 | 供体仓鼠感染剂量（6×10^3 PFU）、感染后共居时间（24小时后共居4小时）、口咽拭子采样时间 阅读提示：Fig. 5J图注及Materials and methods的Viral titer analysis小节 |