病毒-宿主蛋白互作组图谱构建
鉴定每种冠状病毒蛋白的宿主互作因子，为跨病毒比较提供基础。
将SARS-CoV-1和MERS-CoV的结构蛋白、成熟Nsp及预测ORF蛋白进行密码子优化、2xStrep标签标记并克隆到哺乳动物表达载体，转染HEK293T细胞后亲和纯化，通过质谱鉴定高置信度互作因子，并用SAINTexpress和MiST评分。
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比较宿主-冠状病毒蛋白相互作用网络揭示泛病毒疾病机制
Comparative host-coronavirus protein interaction networks reveal pan-viral disease mechanisms.
实验完整度
高包含三种病毒蛋白互作组、蛋白定位、siRNA和CRISPR双遗传筛选、冷冻电镜结构、临床遗传与真实世界队列分析
主要模型
HEK293T细胞 HeLaM细胞 A549-ACE2细胞 Caco-2细胞
重点核对
SARS-CoV-2、SARS-CoV-1和MERS-CoV病毒蛋白2xStrep标签在HEK293T细胞中表达并进行亲和纯化-质谱鉴定，设置GFP-2xStrep和空载体对照，每个诱饵至少三个生物学重复 A549-ACE2细胞中siRNA敲低332个基因后以MOI 0.1感染SARS-CoV-2，72小时后RT-qPCR定量上清病毒基因组，以非靶向siRNA和ACE2 siRNA为对照，每扰动至少三个重复 Caco-2细胞中CRISPR敲除286个基因后以MOI 0.01感染SARS-CoV-2，72小时后在Vero E6细胞上滴定病毒，以非靶向细胞和ACE2敲除为对照，每扰动至少两个重复 ORF9b与Tom70相互验证：共免疫沉淀、共表达纯化、免疫荧光共定位，以及SARS-CoV-2感染Caco-2细胞中Tom70荧光强度定量 真实世界分析：门诊吲哚美辛 versus 塞来昔布比较住院风险；住院典型抗精神病药 versus 非典型抗精神病药比较机械通气风险，采用风险集抽样和倾向评分匹配
摘要
由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的COVID-19大流行对公共卫生和全球经济构成严重威胁。SARS-CoV-2与致死性更强但传播性较低的冠状病毒SARS-CoV-1和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）密切相关。在此，我们对所有三种病毒进行了比较性病毒-人蛋白-蛋白相互作用和病毒蛋白定位分析。随后的功能遗传筛选鉴定了在功能上影响冠状病毒增殖的宿主因子，包括Tom70，一种与SARS-CoV-1和SARS-CoV-2 ORF9b相互作用的线粒体伴侣蛋白，我们使用冷冻电镜对该相互作用进行了结构表征。将遗传验证的宿主因子与COVID-19患者遗传数据和医疗账单记录相结合，鉴定了值得进一步分子和临床研究的分子机制和潜在药物治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 三种高致病性人冠状病毒SARS-CoV-1、SARS-CoV-2和MERS-CoV是否靶向共同的宿主通路，哪些宿主因子可作为广谱抗冠状病毒的候选药物靶点？
- 核心机制
- 三种冠状病毒的病毒-宿主蛋白互作网络存在保守的宿主过程，部分保守过程由非同源病毒蛋白靶向；SARS-CoV-2 ORF9b与线粒体外膜转运受体Tom70结合，ORF9b以螺旋构象插入Tom70底物结合口袋；SARS-CoV-2 ORF8与IL17RA互作并可能调节IL-17信号。
- 主要证据
- 构建并比较了SARS-CoV-2（389个）、SARS-CoV-1（366个）和MERS-CoV（296个）的高置信度宿主互作蛋白；siRNA和CRISPR双筛选鉴定73个影响SARS-CoV-2复制的宿主因子；3 Å冷冻电镜结构解析ORF9b-Tom70复合物；GWAS提示较高可溶性IL17RA水平与较低COVID-19风险相关；真实世界数据分析显示吲哚美辛和典型抗精神病药分别与对照药相比呈现有利趋势。
- 研究意义
- 该整合性比较策略识别了三种致病性冠状病毒的保守机制和候选宿主导向药物靶点，所提出的方法可广泛适用于其他传染因子和疾病领域。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
病毒蛋白亚细胞定位分析
比较三种病毒同源蛋白的定位保守性，并评估感染状态下蛋白定位。
在HeLaM细胞中单独表达2xStrep标签病毒蛋白并进行免疫荧光定位；制备并验证针对SARS-CoV-2蛋白的抗血清，在感染SARS-CoV-2的Caco-2细胞中检测病毒蛋白定位。
跨病毒互作组比较与差异互作评分
量化三种病毒宿主互作的保守与分化程度，识别共享和病毒特异性互作。
对三种病毒共有的病毒诱饵计算互作评分K，并进行聚类、GO富集和差异互作评分（DIS）分析，比较SARS-CoV-1、SARS-CoV-2与MERS-CoV的互作网络。
SARS-CoV-2宿主依赖因子的遗传筛选
鉴定对SARS-CoV-2感染有功能影响的宿主因子。
在A549-ACE2细胞中进行siRNA敲低筛选，在Caco-2细胞中进行CRISPR敲除筛选，感染SARS-CoV-2后分别通过RT-qPCR或Vero E6细胞滴定定量病毒复制，并监测细胞活力和编辑效率。
ORF9b-Tom70互作验证与结构解析
验证ORF9b与Tom70的特异性互作，并解析其分子结合机制。
通过共免疫沉淀、共表达纯化、免疫荧光共定位验证互作；共表达ORF9b和Tom70（109至末端）并纯化复合物，使用冷冻电镜解析结构。
IL17RA-ORF8互作及临床遗传关联分析
验证ORF8与IL17RA互作，并评估IL17RA相关遗传变异与COVID-19风险的关联。
在HEK293T细胞中共免疫沉淀验证ORF8与IL17RA互作；在A549-ACE2细胞中敲低IL17RA检测病毒复制；利用GWAS和GSMR分析预测可溶性IL17RA水平与COVID-19风险的关联。
宿主靶向药物的真实世界效果分析
观察靶向已鉴定宿主因子的药物与COVID-19临床结局的关联。
利用HealthVerity Marketplace医疗账单数据，分别比较门诊新使用吲哚美辛与塞来昔布患者的住院风险，以及住院新使用典型抗精神病药与非典型抗精神病药患者的机械通气风险。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Corning | -- |
| 胎牛血清 | Gibco, Life Technologies | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Corning | -- | |
| 杀稻瘟菌素 | Sigma | -- | |
| GlutaMAX | Gibco | 10569010 | |
| 质粒转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher | -- |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| TransIT-X2转染试剂 | Mirus Bio | -- | |
| PolyJet转染试剂 | SignaGen Laboratories | -- | |
| Fugene HD转染试剂 | Promega | -- | |
| X-tremeGENE 9 DNA转染试剂 | Roche | -- | |
| 亲和纯化 | MagStrep type3珠 | IBA Lifesciences | -- |
| Streptactin Sepharose珠 | IBA | 2-1201-010 | |
| 质谱分析 | Q-Exactive Plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Easy-nLC 1200纳升液相色谱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫荧光 | 兔抗Tom20抗体 | Proteintech | 11802-1-AP |
| 小鼠抗Tom70抗体 | Santa Cruz | sc-390545 | |
| 兔抗Tom40抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-11414 | |
| 小鼠抗Tom22抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-101286 | |
| 小鼠抗Strep标签抗体 | QIAGEN | 34850 | |
| Alexa Fluor 488鸡抗小鼠IgG | Invitrogen | A21200 | |
| Alexa Fluor 488鸡抗兔IgG | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 568驴抗羊IgG | Invitrogen | A21099 | |
| Alexa Fluor Plus 488山羊抗兔 | ThermoFisher | A32731 | |
| Alexa Fluor Plus 594山羊抗小鼠 | ThermoFisher | A32742 | |
| DAPI | Thermo Scientific | -- | |
| Western blot | 山羊抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶 | BioRad | 170-6516 |
| 兔抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4967 | |
| CRISPR敲除 | SpCas9核酸酶 | Aldevron | 9212 |
| SF缓冲液 | Lonza | V5SC-2002 | |
| Lonza HT 384孔核转染系统 | Lonza | AAU-1001 | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光法细胞活力检测 | Promega | G7571 |
| 病毒滴定 | 兔抗SARS-CoV核衣壳蛋白抗体 | Rockland | 200-401-A50 |
| 小鼠抗SARS-CoV核衣壳蛋白抗体 | Novus Biologicals | NB100-56576 | |
| 药物处理 | 瑞德西韦 | SELLECK CHEMICALS LLC | S8932 |
| 白细胞介素-17A | Millipore-Sigma | SRP0675 | |
| 吲哚美辛 | -- | -- | |
| 塞来昔布 | -- | -- | |
| RNA提取与逆转录 | Direct-zol RNA提取试剂盒 | Zymogen | R2060 |
| Superscript III逆转录酶 | ThermoFisher | 18080-044 | |
| RT-qPCR | Luna通用一步法RT-qPCR试剂盒 | New England Biolabs | -- |
| Maxima SYBR green/Rox qPCR预混液 | ThermoFisher | K0221 | |
| 冷冻电镜 | Titan Krios冷冻电镜 | ThermoFisher | -- |
| K3相机 | Gatan | -- | |
| 蛋白纯化 | Superdex 200 increase 10/300 GL色谱柱 | GE Healthcare | -- |
| Ni-NTA superflow树脂 | Qiagen | -- | |
| MonoQ 10/100色谱柱 | GE Healthcare | -- | |
| Emulsiflex C3细胞破碎仪 | Avestin | -- | |
| 蛋白表达 | LOBSTR大肠杆菌表达菌株 | Kerafast | EC1002 |
| pET29-b(+)载体 | -- | -- | |
| pLVX-EF1alpha-IRES-Puro载体 | Takara/Clontech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒-宿主蛋白互作组图谱构建 | 诱饵蛋白标签策略、转染细胞类型、生物学重复数、高置信度评分阈值（MiST和SAINTexpress） 阅读提示：Materials and methods中'Coronavirus annotation and plasmid cloning'、'Transfection and cell harvest for immunoprecipitation experiments'、'Anti–Strep tag affinity purification'和'High-confidence protein interaction scoring'小节 |
| SARS-CoV-2宿主依赖因子遗传筛选 | 细胞系、筛选基因数量、感染MOI、感染后检测时间、病毒定量方法、z-score阈值、重复数 阅读提示：Materials and methods中'siRNA library and transfection in A549-ACE2 cells'、'Viral infection and quantification assay in A549-ACE2 cells'、'Cells, virus, and infections for Caco-2 Cas9 knockout screen'和'Quantitative analysis and scoring of knockdown and knockout library screens'小节，以及Fig. 5图注 |
| ORF9b-Tom70互作验证与结构解析 | 共免疫沉淀细胞系、共表达宿主菌、诱导条件、纯化标签、冷冻电镜分辨率、构建体残基范围 阅读提示：Materials and methods中'Coimmunoprecipitation assays for ORF9b and Tom70'、'Coexpression and purification of ORF9b-Tom70 (residues 109 to end) complexes'和'Cryo-EM sample preparation and data collection'小节，以及Fig. 6和Fig. 7图注 |
| IL17RA-ORF8互作与遗传关联分析 | IL-17A处理浓度和时间、共免疫沉淀细胞系、GSMR使用的SNP独立性阈值、GWAS数据集版本、结局定义 阅读提示：Materials and methods中'SARS-CoV-2 ORF8 and IL17RA coimmunoprecipitation'、'Transfections for IL-17A treatment studies'和'Computational human genetics analysis'小节，以及Fig. 8图注 |
| 真实世界药物效果分析 | 数据来源、纳入排除标准、匹配变量、倾向评分协变量、主要结局定义、随访起止时间 阅读提示：Materials and methods中'Real-world data source and analysis'、'Observation of hospitalization outcomes in outpatient new users of indomethacin (treatment arm) versus celecoxib (active comparator) using real-world data'和'Observation of mechanical ventilation outcomes in inpatient new users of typical antipsychotics (treatment arm) versus atypical antipsychotics (active comparator) using real-world data'小节，以及Fig. 9图注和table S11 |