p21/p27-CDK4-CycD1复合物结构解析
阐明p21和p27与CDK4-CycD1结合的结构基础及其对激酶构象的影响
解析p21-CDK4-CycD1（3.2 Å）、p27-CDK4-CycD1（2.3 Å）及phosp27-CDK4-CycD1晶体结构，比较CDK4 N-lobe、β-sheet、激活段和C-helix构象
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- 移动端
p27通过别构激活细胞周期蛋白依赖性激酶4并拮抗palbociclib抑制
p27 allosterically activates cyclin-dependent kinase 4 and antagonizes palbociclib inhibition.
实验完整度
高含p21/p27-CDK4-CycD1晶体结构、重组激酶动力学、ITC、XO44标记、细胞内IP及多种乳腺癌细胞系验证
主要模型
MCF7乳腺癌细胞 MDA-MB-231乳腺癌细胞 T98G胶质瘤细胞 重组CDK4-CycD1/p27/p21蛋白复合物
重点核对
重组CDK4-CycD1二聚体与phosp27三聚体对Rb771-928的32P-ATP激酶活性比较 palbociclib、ribociclib、abemaciclib浓度0.2 μM至16.2 μM、3倍递增对重组复合物的抑制 ITC测定palbociclib与p27对CDK4单体、二聚体、三聚体的结合亲和力 XO44（2 μM，37℃ 30 min）标记细胞及重组CDK4复合物，palbociclib（500 nM，4 hr）竞争 MCF7、MDA-MB-231、T98G细胞中p27或CDK4免疫沉淀复合物的激酶活性及palbociclib敏感性
摘要
p27蛋白是细胞增殖的经典负调控因子，主要通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）发挥作用。在某些情况下p27与活性CDK4相关联，但尚未有激活机制的描述。我们发现，p27在被酪氨酸激酶磷酸化后，可别构激活CDK4-CycD1。结构和生化数据表明，磷酸化p27（phosp27）与CDK4的结合改变了激酶ATP位点，从而促进视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白（Rb）及其他底物的磷酸化。出乎意料的是，纯化的及内源性phosp27-CDK4-CycD1复合物对CDK4靶向药物palbociclib不敏感。在乳腺肿瘤细胞中，palbociclib反而主要靶向单体CDK4和CDK6（CDK4/6）。我们的数据将phosp27-CDK4-CycD1表征为一种对临床相关CDK4/6抑制剂难治的活性Rb激酶。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- p21和p27是否以及如何直接刺激CDK4催化活性，p27磷酸化如何介导该激活，以及p27如何影响CDK4对palbociclib等化学抑制剂的敏感性。
- 核心机制
- p27被酪氨酸激酶（如Brk/PTK6）磷酸化，尤其Y74磷酸化削弱p27 D2结构域与CDK4 N-lobe的界面，使CDK4 N-lobe发生β-sheet重排、释放激活段并将催化赖氨酸K35置于可协调ATP的位置，从而别构激活CDK4-CycD1；该N-lobe构象改变使palbociclib无法结合三聚体。
- 主要证据
- p21-CDK4-CycD1与p27-CDK4-CycD1及phosp27-CDK4-CycD1晶体结构；重组二聚体与phosp27三聚体的稳态激酶动力学；ITC结合实验；XO44 ATP位点占位标记；palbociclib-biotin沉淀；MCF7、MDA-MB-231、T98G细胞中p27/CDK4免疫沉淀激酶活性。
- 研究意义
- 将phosp27-CDK4-CycD1定义为对临床相关CDK4/6抑制剂难治的活性Rb激酶，提示palbociclib在乳腺癌细胞中主要靶向单体CDK4/6并间接抑制CDK2，其机制类似p16-INK4家族对单体CDK4的隔离。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
重组CDK4复合物激酶活性与动力学分析
量化p21/p27及酪氨酸磷酸化对CDK4-CycD1催化活性的影响
以32P-ATP标记检测Rb771-928、Rb771-874、Cdc61-119、p107949-1068的磷酸化，比较K4D1/-、K4D1/p21、K4D1/p27、K4D1/phosp21、K4D1/phosp27
Y74磷酸化解除p27 D2抑制的机制验证
确定酪氨酸磷酸化如何削弱p27 D2与CDK4 N-lobe结合
比较未磷酸化p27、phosp27及p21结构，构建p27 3E（Y74/Y88/Y89磷酸化模拟）和ΔD2（25-60）突变体并测定Rb771-928磷酸化
palbociclib对重组及内源性CDK4复合物的抑制与结合检测
检验phosp27-CDK4-CycD1是否对CDK4/6抑制剂不敏感
测定palbociclib、ribociclib、abemaciclib对重组二聚体和phosp27三聚体的抑制；ITC测定palbociclib与p27结合；palbociclib-biotin沉淀
细胞内CDK4复合物靶向与细胞周期效应验证
确定细胞内palbociclib实际结合的CDK4群体及细胞周期阻滞与CDK2而非CDK4抑制的相关性
XO44标记、Superdex200凝胶过滤、p27/CDK4/CycD1/CycE1免疫沉淀激酶活性、EdU掺入和PI染色
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证激酶活性与动力学
验证分子结合与靶点占位
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白纯化 | GS4B亲和层析 | -- | -- |
| Source 15Q阴离子交换色谱 | GE Healthcare | -- | |
| Superdex 75柱 | GE Healthcare | -- | |
| Superdex 200柱 | GE Healthcare | -- | |
| Superdex200 Increase 10/300 GL柱 | -- | -- | |
| 质谱分析 | SCIEX X500 QTOF质谱仪 | SCIEX | -- |
| 晶体学数据收集 | 8.3.1光束线 | Advanced Light Source, Laurence Berkeley National Laboratory | -- |
| XO44标记 | TAMRA-叠氮 | -- | -- |
| TBTA | -- | -- | |
| TCEP | -- | -- | |
| cOmplete无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| 蛋白浓度测定 | Pierce Rapid Gold BCA实验 | Thermo | -- |
| 凝胶过滤 | DNase I | NEB | -- |
| LC-MS分析 | Waters Xevo G2-XS QTof质谱仪 | Waters | -- |
| ACQUITY UPLC Protein BEH C4柱 | Waters | -- | |
| 等温滴定量热 | Micro Cal VP-ITC微量热仪 | Micro Cal | -- |
| 免疫沉淀 | 抗p27抗体 | SCBT | DCS-72 |
| 抗CDK2抗体 | SCBT | D-12 | |
| 蛋白A/G PLUS珠 | SCBT | -- | |
| 抗CycD1抗体 | Invitrogen | MA5-12707 | |
| 正常小鼠IgG1 | Cell Signaling Technology | 5415 | |
| Western blot | 抗磷酸化Rb（S780）抗体 | Cell Signaling Technology | 9307L |
| 抗磷酸化Rb（S807/S811）抗体 | Cell Signaling Technology | 8516S | |
| 免疫沉淀 | 抗CycE1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-377100 |
| 激酶实验 | Halt蛋白酶抑制剂 | Thermo Fisher | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组CDK4复合物激酶活性 | CDK4 0.5 μM、底物30 μM、ATP 250 μM、32P-γ-ATP 100 μCi、反应30 min、三次重复；CDK4采用T172E磷酸化模拟 阅读提示：Materials and Methods中Kinase assays小节；Fig. 3E-G及Fig. S4 |
| 抑制剂敏感性检测 | palbociclib、ribociclib、abemaciclib浓度0.2 μM至16.2 μM、3倍递增；表中未明确说明各药物的具体处理时间 阅读提示：Fig. 5B及Fig. S8A图注；Kinase assays小节 |
| ITC结合实验 | 15°C；40 μM纯化CDK4-CycD1、phosp27-CDK4-CycD1和GST-CDK4；0.5 mM palbociclib滴定；p27 250 μM滴定40 μM GST-CDK4，加或不加50 μM palbociclib 阅读提示：Materials and Methods中Isothermal Titration Calorimetry小节；Fig. 5C及Fig. S8B、S8C |
| XO44标记与竞争 | XO44 2 μM、37℃ 30 min；palbociclib预处理60 min，浓度递增；MCF7与MDA-MB-231细胞；6孔板每孔500,000细胞 阅读提示：Materials and Methods中XO44 labeling assays小节；Fig. 6A、B及Fig. S10 |
| 内源性复合物免疫沉淀激酶活性 | 每份1 mg全细胞提取物；anti-p27 2 μg、anti-CDK2 2 μg、CDK4 C端抗血清20 μL；protein A/G PLUS珠25 μL；4℃ 2 hr；MCF7、MDA-MB-231、T98G细胞 阅读提示：Materials and Methods中Kinase assays小节免疫沉淀部分；Fig. 5D、E及Fig. 8B |
| 细胞周期与palbociclib处理 | palbociclib 500 nM处理4或48 hr；EdU掺入检测S期；乳腺癌细胞与T98G细胞敏感性差异 阅读提示：Fig. 8A及Fig. S11图注；Fig. 8A |
| 晶体结构解析 | CDK4 1-303含ΔG45-G47、G43E、G44E；CycD1 16-267；p27KID 25-93；p21KID 14-81；10 mg/mL、22°C；PEG 8000或PEG 3350；25%甘油 阅读提示：Materials and Methods中Crystallization, data collection, structure determination, and model refinement小节；Table S1 |