系统性筛选增强环状RNA翻译的RNA结合蛋白

Systematic screen of RNA binding proteins that enhance circular RNA translation.

作者信息Qian-Yun Lu, Si-Qi Wang, Yan-Wen Ye, Tong Wei, Yun Yang, Huanhuan Y Wei, Zefeng Wang

PMID42982803

期刊Nat Commun

发布时间2026-11-04

DOI10.1038/s41467-026-77614-w

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实验完整度

高

包含HEK 293T细胞报告系统筛选、截短体功能验证、RIP-qPCR、shRNA敲低及多种IRES报告验证

主要模型

HEK 293T细胞 cFluc环状荧光素酶报告系统 PUF-RBP系联系列融合蛋白多种IRES驱动的circRNA报告系统

重点核对

以TE≥1.3为阈值从110个RBP中鉴定68个翻译激活因子（n=3生物学独立转染）通过PUF结构域将RBP系连至circRNA，并以PUF-only对照归一化 LARP7结合基序插入报告基因后经RIP-qPCR验证结合，过表达和shRNA敲低验证翻译依赖 sPLS-DA模型以110个RBP为训练集，7折交叉验证评估，并实验验证8个预测激活因子在CVB3、EMCV、HCV、CSFV四种IRES报告系统中检测RBP的IRES特异性激活

摘要

可翻译的环状RNA（circRNA）因其稳定性提高而具有更长的表达窗口，已成为传统mRNA疗法的一种有前景的替代方案。circRNA的翻译主要由内部核糖体进入位点（IRES）或IRES样元件驱动，并受到多种反式作用RNA结合蛋白（RBP）的严格调控。本文中，我们建立了一种基于细胞的系统，用于系统性筛选增强circRNA翻译的RBP，鉴定出68个蛋白为非经典翻译的候选激活因子。这些翻译激活因子参与RNA加工、核糖体生物发生和翻译起始等广泛的生物学过程。我们进一步设计了一种机器学习算法，用于提取这些激活因子的共有序列特征并预测更多具有翻译激活活性的潜在RBP。随后，新鉴定和预测的激活因子被验证能以情境依赖的方式促进IRES介导的circRNA翻译。总体而言，本研究为IRES相关的反式作用因子提供了新见解，并扩展了RNA合成生物学中工程化RBP的工具箱。

构建并验证环状荧光素酶报告系统

建立可特异性检测circRNA翻译并排除线性mRNA干扰的报告系统。

将Fluc CDS反向拆分为两个片段，两侧内含子含互补元件，通过反向剪接生成cFluc；反向插入Rluc作为转染对照；在cFluc起始和终止密码子间插入两个串联PUF结合位点；用eIF4E和eIF4G2的PUF融合验证系统。

PUF-RBP文库筛选影响circRNA翻译的RBP

从候选RBP中鉴定能增强circRNA翻译效率的激活因子。

将110个候选RBP的全长CDS克隆至PUF系连载体，与cFluc报告共转染，检测荧光素酶活性及circRNA/线性RNA水平，计算翻译效率、反向剪接效率和circRNA量。

LARP7结合基序招募内源因子的功能验证

验证将翻译激活因子的结合基序插入circRNA可招募内源因子并增强翻译。

基于eCLIP数据选择LARP7及其在UBAP2、HSPA8、TMEM107上的结合位点，插入cFluc报告；通过RIP-qPCR验证结合，过表达LARP7检测TE，并在CVB3 IRES报告及LARP7敲低细胞中验证翻译依赖。

翻译激活因子功能结构域截短分析

确定激活因子中足以促进circRNA翻译的功能模块。

选取12个代表性激活因子，构建N端和C端截短体并与PUF融合，与cFluc报告共转染HEK 293T细胞，检测TE值。

构建sPLS-DA机器学习模型预测新激活因子

基于氨基酸序列特征预测具有翻译激活活性的RBP。

以110个RBP的TE数据为训练集，计算单肽、二肽和三肽频率，稀疏性阈值0.95过滤后保留300个特征，构建sPLS-DA模型，7折交叉验证评估，并对1432个报道的RBP进行预测，实验验证8个预测激活因子。

多IRES报告系统验证激活因子的IRES特异性

检测新鉴定和预测的激活因子是否以IRES依赖方式促进circRNA翻译。

将CVB3、EMCV、HCV、CSFV四种IRES序列插入PUF系连的circRNA荧光素酶报告，与PUF-RBP共表达，检测翻译效率。

实验环节	名称	品牌	货号
报告基因质粒构建	EcoRI限制性内切酶	NEB	R3101V
SpeI限制性内切酶	NEB	R3133V
RBP系连文库构建	XbaI限制性内切酶	NEB	R0145V
NotI限制性内切酶	NEB	R3189V
SuperScript III逆转录酶	Invitrogen	18080044
ClonExpress Entry一步克隆试剂盒	Vazyme	C112-01
细胞培养与转染	Lipofectamine 3000转染试剂	Invitrogen	L3000075
Opti-MEM培养基	Invitrogen	51985091
双荧光素酶检测	被动裂解液	Progema	E1910
LAR II荧光素酶检测试剂	Progema	E1910
Stop & Glo试剂	Progema	E1910
RNA免疫沉淀	RIP裂解缓冲液	Sigma	17-700
抗Flag抗体	Sigma	B3111
对照IgG	CST	2729S
RIP洗涤缓冲液	Sigma	17-700
TRIzol试剂	Thermo Fisher	--
PrimeScript逆转录试剂盒	TaKaRa	RR092A
2×通用SYBR Green快速qPCR预混液	Abclonal	RK21203
RNA提取与实时PCR	AceQ qPCR SYBR Green预混液	Vazyme	Q111-02
shRNA敲低质粒构建	T4多核苷酸激酶	NEB	M0201V
AgeI限制性内切酶	NEB	R3552S
慢病毒包装	Lipofectamine 3000转染试剂	Thermo Fisher	L300007
Western blot	5×SDS蛋白上样缓冲液	Beyotime	P0280
4-20% SurePAGE凝胶	GenScript	M00657
增强化学发光检测试剂盒	NCM Biotech	P10300

实验环节

名称

品牌

货号

报告基因质粒构建

EcoRI限制性内切酶

NEB

R3101V

SpeI限制性内切酶

NEB

R3133V

RBP系连文库构建

XbaI限制性内切酶

NEB

R0145V

NotI限制性内切酶

NEB

R3189V

SuperScript III逆转录酶

Invitrogen

18080044

ClonExpress Entry一步克隆试剂盒

Vazyme

C112-01

细胞培养与转染

Lipofectamine 3000转染试剂

Invitrogen

L3000075

Opti-MEM培养基

Invitrogen

51985091

双荧光素酶检测

被动裂解液

Progema

E1910

LAR II荧光素酶检测试剂

Progema

E1910

Stop & Glo试剂

Progema

E1910

RNA免疫沉淀

RIP裂解缓冲液

Sigma

17-700

抗Flag抗体

Sigma

B3111

对照IgG

CST

2729S

RIP洗涤缓冲液

Sigma

17-700

TRIzol试剂

Thermo Fisher

PrimeScript逆转录试剂盒

TaKaRa

RR092A

2×通用SYBR Green快速qPCR预混液

Abclonal

RK21203

RNA提取与实时PCR

AceQ qPCR SYBR Green预混液

Vazyme

Q111-02

shRNA敲低质粒构建

T4多核苷酸激酶

NEB

M0201V

AgeI限制性内切酶

NEB

R3552S

慢病毒包装

Lipofectamine 3000转染试剂

Thermo Fisher

L300007

Western blot

5×SDS蛋白上样缓冲液

Beyotime

P0280

4-20% SurePAGE凝胶

GenScript

M00657

增强化学发光检测试剂盒

NCM Biotech

P10300

环节	核对要点
PUF-RBP文库筛选	HEK 293T细胞转染密度35-45%；每孔0.72 μg质粒（120 ng报告质粒+600 ng PUF-RBP质粒）；转染后36 h收集；n=3生物学独立转染；TE≥1.3为激活阈值阅读提示：Methods中Cell culture and transfection及Results中Systematic screen of RBPs that affect circRNA translation；Fig. 1B、Fig. 2E
双荧光素酶报告检测	200 μL Passive Lysis Buffer裂解30 min；−80 °C过夜冻存；10 μL裂解液检测；firefly活性以Renilla活性归一化阅读提示：Methods中Dual luciferase assay
LARP7结合基序功能验证	LARP7结合基序来源（UBAP2 5′UTR、HSPA8 3′UTR、TMEM107 3′UTR）；Flag-LARP7或PUF-LARP7过表达；RIP-qPCR以IgG为对照并以spike-in RNA归一化；LARP7-sh1/sh2敲低及5 μg/ml puromycin筛选阅读提示：Results中Translation activators exhibit ITAF-Like features and function；Fig. 3E–J；Methods中RNA-Immunoprecipitation及Gene knockdown with lentiviral shRNA
sPLS-DA模型训练与验证	训练集为110个RBP；TE阈值1.3二分类；单肽/二肽/三肽频率特征；稀疏性阈值0.95；最终300个特征；7折交叉验证且特征选择在每折内独立进行；预测概率≥0.9 阅读提示：Methods中sPLS-DA Model construction；Fig. 5A–C
多IRES报告系统验证	CVB3（IV组）、EMCV（III组）、HCV（II组）、CSFV（II组）IRES序列；PUF结合位点插入IRES与cFluc终止密码子之间；eIF4G2为阳性对照；n=3生物学独立转染阅读提示：Results中The translation activators function as ITAFs to promote circRNA translation in an IRES-specific manner；Fig. 6A–F

环节

核对要点

PUF-RBP文库筛选

HEK 293T细胞转染密度35-45%；每孔0.72 μg质粒（120 ng报告质粒+600 ng PUF-RBP质粒）；转染后36 h收集；n=3生物学独立转染；TE≥1.3为激活阈值

阅读提示：Methods中Cell culture and transfection及Results中Systematic screen of RBPs that affect circRNA translation；Fig. 1B、Fig. 2E

双荧光素酶报告检测

200 μL Passive Lysis Buffer裂解30 min；−80 °C过夜冻存；10 μL裂解液检测；firefly活性以Renilla活性归一化

阅读提示：Methods中Dual luciferase assay

LARP7结合基序功能验证

LARP7结合基序来源（UBAP2 5′UTR、HSPA8 3′UTR、TMEM107 3′UTR）；Flag-LARP7或PUF-LARP7过表达；RIP-qPCR以IgG为对照并以spike-in RNA归一化；LARP7-sh1/sh2敲低及5 μg/ml puromycin筛选

阅读提示：Results中Translation activators exhibit ITAF-Like features and function；Fig. 3E–J；Methods中RNA-Immunoprecipitation及Gene knockdown with lentiviral shRNA

sPLS-DA模型训练与验证

训练集为110个RBP；TE阈值1.3二分类；单肽/二肽/三肽频率特征；稀疏性阈值0.95；最终300个特征；7折交叉验证且特征选择在每折内独立进行；预测概率≥0.9

阅读提示：Methods中sPLS-DA Model construction；Fig. 5A–C

多IRES报告系统验证

CVB3（IV组）、EMCV（III组）、HCV（II组）、CSFV（II组）IRES序列；PUF结合位点插入IRES与cFluc终止密码子之间；eIF4G2为阳性对照；n=3生物学独立转染

阅读提示：Results中The translation activators function as ITAFs to promote circRNA translation in an IRES-specific manner；Fig. 6A–F

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