WaLP消化产生SUMO残留KGG肽段
验证WaLP能否在SUMO化位点产生可用于富集的KGG肽段
用WaLP消化Hela和HCT116细胞裂解液，以胰蛋白酶消化作为泛素化对照，后续进行KGG肽段免疫亲和富集和质谱鉴定。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
天然条件下内源性SUMO修饰的位点特异性鉴定与定量
Site-specific identification and quantitation of endogenous SUMO modifications under native conditions.
实验完整度
高涵盖细胞系、小鼠组织样本及SILAC定量，并通过SENP1/2和Usp2cc处理进行特异性验证。
主要模型
Hela细胞 HCT116细胞 BALB/c小鼠脑、心、肌肉和肝脏组织
重点核对
SENP1/2处理使WaLP消化鉴定的88%位点至少降低两倍，而胰蛋白酶消化的KGG肽段不变 Usp2cc处理使WaLP消化的KGG肽段仅<2%降低，而胰蛋白酶消化的97%降低 MG132处理HCT116细胞4小时，SILAC标记定量SUMO和泛素位点 WaLP与胰蛋白酶平行消化同一裂解液，分别鉴定SUMO和泛素位点
摘要
小泛素样修饰蛋白（SUMO）修饰调控众多细胞过程。与泛素不同，内源性SUMO化蛋白的检测受限于SUMO蛋白C端尾部缺乏天然存在的蛋白酶切割位点。靶蛋白上SUMO化位点的蛋白质组水平检测通常需要异位表达引入了胰蛋白酶切割位点的突变型SUMO。在此，我们报道了一种利用α-裂解蛋白酶WaLP进行蛋白质组水平、位点水平内源性SUMO化检测的方法。WaLP消化SUMO化蛋白可产生在SUMO修饰位点含有SUMO残留双甘氨酰赖氨酸（KGG）的肽段。利用先前开发的含KGG肽段的免疫亲和分离结合质谱分析，我们鉴定了1209个独特的内源性SUMO修饰位点。我们还通过平行定量泛素化和SUMO化肽段，展示了蛋白酶体抑制对泛素和SUMO修饰蛋白质组的影响。这一方法学进展使得能够在完全天然条件下确定内源性SUMO化蛋白。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否在完全不引入突变型SUMO的天然条件下，实现蛋白质组水平的内源性SUMO化位点鉴定与定量？
- 核心机制
- WaLP在SUMO C端TGG序列的苏氨酸后切割，在靶蛋白SUMO附着位点留下KGG残留，从而利用已有的KGG肽段免疫亲和富集和质谱流程鉴定SUMO化位点。
- 主要证据
- 在Hela和HCT116细胞中鉴定1209个独特内源性SUMO化位点，其中826个为新位点；SENP1/2处理使88%的WaLP位点降低至少两倍，而Usp2cc处理仅使<2%的WaLP位点降低；在小鼠四种组织中鉴定144个位点。
- 研究意义
- 该方法可在完全天然条件下鉴定内源性SUMO化位点，并可从同一份样本平行分析泛素化和SUMO化，适用于包括人体组织在内的样本。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SENP1/2和Usp2cc处理验证方法特异性
验证WaLP产生的KGG肽段主要来源于SUMO化而非泛素化
天然细胞裂解液未经处理或经SENP1/2或Usp2cc处理，随后用胰蛋白酶或WaLP消化，Western blot检测SUMO1、SUMO2/3和泛素，质谱定量KGG肽段变化。
平行鉴定泛素化和SUMO化位点
展示同一份样本可同时分析泛素和SUMO修饰位点
将同一细胞裂解液分成两半，一半用胰蛋白酶消化分析泛素化，另一半用WaLP消化分析SUMO化，分别进行KGG肽段富集和质谱鉴定。
MG132处理后SILAC定量SUMO和泛素位点
评估蛋白酶体抑制对SUMO化和泛素化蛋白质组的影响
SILAC标记的HCT116细胞用MG132或DMSO处理，混合后裂解，分别用胰蛋白酶和WaLP消化，KGG肽段富集和质谱定量。
小鼠组织内源性SUMO化位点鉴定
验证方法可应用于天然组织样本
取BALB/c小鼠脑、心、肌肉和肝脏组织，匀浆裂解，WaLP消化，KGG肽段富集和质谱鉴定。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | MEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 细胞裂解 | 蛋白酶抑制剂片剂 | Roche | -- |
| N-乙基马来酰亚胺 | -- | -- | |
| 去SUMO化处理 | SENP1 | Life Sensors | -- |
| SENP2 | Life Sensors | -- | |
| 去泛素化处理 | Usp2cc | Enzo Life Sciences | -- |
| Western blot | 抗泛素抗体 | EMD Millipore | MAB1510 |
| 抗SUMO1抗体 | Cell Signaling Technologies | 4930 | |
| 抗SUMO2/3抗体 | Cell Signaling Technologies | 4971 | |
| 抗泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 3933 | |
| 多肽富集 | UbiScan珠 | Cell Signaling Technology | -- |
| 多肽脱盐 | Sep-Pak柱 | Waters Corp. | -- |
| 质谱分析 | Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪 | Thermo | -- |
| EASY-nLC 1200 | Thermo | -- | |
| EASY-Spray分析柱 | Thermo | -- | |
| MassPREP蛋白质消化标准混合物1 | Waters | -- | |
| SILAC标记 | 13C6 15N2赖氨酸 | Cambridge Isotope Labs | -- |
| DMEM SILAC培养基 | Thermo Scientific/Pierce | -- | |
| 蛋白酶体抑制 | MG132 | Sigma | -- |
| 胰蛋白酶消化 | 胰蛋白酶 | Sigma | -- |
| 多肽脱盐 | tC18 Sep-Pak | Waters | -- |
| 多肽分级 | BEH C18柱 | Waters | -- |
| 多肽脱盐 | Sep-Pak Classic C18柱 | Waters | -- |
| 质谱分析 | Orbitrap Fusion质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| Proxeon Easy nLC 1000 | Thermo Scientific | -- | |
| C18反相树脂 | Sepax Technologies | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| WaLP消化与KGG肽段富集 | WaLP与底物比例1:100、37°C过夜；UbiScan beads用量10 µl/5–7 mg肽段；富集缓冲液pH 7.5 阅读提示：Methods中Enrichment of KGG-containing peptides及SILAC quantitation of Ub and SUMO小节 |
| SENP1/2和Usp2cc特异性验证 | SENP1/2剂量（2、4、6 U/mg用于验证，10 U/mg用于质谱实验）、处理4小时25°C；Usp2cc 1 μg/mg或1:500、4小时；Western blot抗体货号和稀释比 阅读提示：Methods中SENP1 and SENP2 deSUMOylation小节及Fig. 3图注 |
| MG132处理与SILAC定量 | MG132浓度10 μM、处理4小时、DMSO对照；SILAC标记氨基酸浓度；生物重复数；log2比值变化判定标准（偏离中位数1个标准差） 阅读提示：Methods中SILAC quantitation of Ub and SUMO小节及Fig. 4、Fig. 5图注 |
| 小鼠组织样本处理 | BALB/c小鼠组织来源；组织种类脑、心、肌肉、肝脏；WaLP重量比1:100、37°C过夜 阅读提示：Methods中Preparation of tissue samples小节 |