建立RQC报告系统并验证Rqt1依赖性
确认Hel2/Rqt1及其泛素化活性对RQC触发步骤的必要性。
使用R(CGN)12报告基因在ltn1∆背景中检测停滞产物，分析hel2∆、hel2∆ltn1∆、Ubc4缺陷及Hel2 RING突变体的影响。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
停滞核糖体的泛素化触发核糖体相关质量监控
Ubiquitination of stalled ribosome triggers ribosome-associated quality control.
实验完整度
高结合酵母遗传学、体外泛素化、核糖体图谱和冷冻电镜多层级证据，并有人类细胞验证。
主要模型
酿酒酵母（S. cerevisiae）报告基因系统 HEK293T细胞
重点核对
R(CGN)12报告基因中CGA-CGA双密码子诱导旋转状态停滞核糖体 uS10 K6/8R突变完全消除uS10泛素化并废除RQC Rqt2 K316R突变消除ATP水解并废除RQC Rqt3 CUE结构域泛素结合突变（Ub-m）显著减弱RQC底物产生
摘要
多碱性序列引起的翻译停滞诱导核糖体停滞，停滞产物被核糖体介导的质量监控（RQC）系统降解。本文报道，E3泛素连接酶Hel2（或RQT1）对40S核糖体蛋白uS10的泛素化是RQC所必需的。我们鉴定了一个RQC触发（RQT）亚复合物，由RNA解旋酶家族蛋白Slh1/Rqt2、泛素结合蛋白Cue3/Rqt3和yKR023W/Rqt4组成，是RQC所必需的。RQT突变体的RQC缺陷与对茴香霉素（使核糖体停滞在旋转构象）的敏感性相关。冷冻电镜分析显示，Hel2结合的核糖体主要为带有杂合tRNA的旋转构象。核糖体图谱分析揭示，停滞在旋转状态且P-A位点具有特定密码子对的核糖体作为RQC底物。Rqt1特异性泛素化这些停滞的核糖体，将它们靶向RQT复合物，从而允许后续RQC反应，包括停滞核糖体解离为亚基。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 核糖体泛素化如何诱导RQC，以及停滞核糖体的何种特征被RQT系统识别？
- 核心机制
- Hel2/Rqt1泛素化停滞核糖体40S蛋白uS10的K6/K8残基，RQT复合物通过Rqt3结合泛素、Rqt2水解ATP，触发停滞核糖体解离为亚基，进而由Ltn1泛素化60S上的肽酰-tRNA。
- 主要证据
- 酵母报告基因分析显示uS10 K6/8R和RQT突变体废除RQC；核糖体图谱显示短足迹在CGA-CGA双密码子积累；冷冻电镜显示Rqt1结合核糖体77.6%为旋转状态；人类细胞中ASCC3敲低减少RQC底物。
- 研究意义
- 揭示了核糖体泛素化在RQC中的保守触发作用，并鉴定了RQT复合物及其人类同源物ASCC3在RQC中的功能。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定uS10泛素化位点并验证其功能
确定Rqt1泛素化的核糖体蛋白靶点及关键赖氨酸残基。
纯化核糖体进行质谱鉴定，构建uS3 K212R、uS10 K6/8R突变体，进行体外泛素化重建和R(CGN)12报告基因分析。
鉴定RQT复合物并验证其功能
寻找RQC下游因子并确认其必要性。
纯化Rqt1-核糖体复合物进行质谱鉴定，构建rqt2∆、rqt3∆、rqt4∆及双突变体，进行R(CGN)12报告基因分析、亲和纯化和多聚核糖体分析。
验证Rqt3泛素结合和Rqt2 ATPase活性
确定RQT复合物触发RQC的关键生化活性。
进行Rqt3 CUE结构域体外泛素结合实验，构建Rqt3-Ub-m和Rqt2-K316R突变体，进行报告基因分析、多聚核糖体分析和表达检测。
核糖体图谱分析停滞核糖体特征
确定RQC靶向的核糖体构象和密码子特征。
对表达R(CGN)12报告基因的酵母进行核糖体图谱分析，比较短足迹（20–22 nt）和长足迹（27–29 nt）在双密码子上的积累，并测试top双密码子报告基因。
冷冻电镜分析Rqt1结合核糖体的构象
直接观察Rqt1结合核糖体的tRNA状态和旋转构象。
纯化Rqt1-FTP结合的核糖体和uL30-TAP对照，进行冷冻电镜单颗粒分析和三维分类。
验证人类同源物的功能
检验RQC机制的保守性。
在HEK293T细胞中进行Listerin、ZNF598、ASCC3敲低，使用K(AAA)24报告基因检测停滞产物，并进行免疫共沉淀和细胞质/核分离。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 |
| ImageQuant LAS4000成像仪 | GE Healthcare | -- | |
| 多聚核糖体分析 | P28S转子 | Hitachi Koki | -- |
| 核糖体纯化 | M2 FLAG亲和树脂 | Sigma | -- |
| 质谱分析 | 胰蛋白酶 | Promega | -- |
| Q Exactive质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| Easy nLC1000纳流液相色谱 | Thermo Scientific | -- | |
| RQT复合物纯化 | IgG偶联Dynabeads | Invitrogen | -- |
| Ni-NTA磁珠 | Novagen | -- | |
| 苯甲酸酶 | MERCK | -- | |
| 体外泛素结合实验 | 淀粉糖树脂 | NEB | -- |
| 谷胱甘肽树脂 | GE Healthcare | -- | |
| 核糖体图谱分析 | RNase I | Epicentre | -- |
| 5′ DNA腺苷酸化试剂盒 | NEB | -- | |
| HiSeq 2000/4000测序仪 | Illumina | -- | |
| 冷冻电镜 | Vitrobot Mark IV | FEI Company | -- |
| Titan Krios透射电子显微镜 | FEI Company | -- | |
| Falcon II直接电子探测器 | FEI Company | -- | |
| 细胞培养与转染 | PEI-max试剂 | Cosmo Bio | -- |
| 免疫沉淀 | Protein G磁珠 | Invitrogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| R(CGN)12报告基因分析 | 酵母遗传背景（ltn1∆等）、报告基因拷贝数或表达水平、培养条件 阅读提示：Methods 'Yeast strains and genetic methods and plasmid construct'及Supplementary Data 3；图1a |
| uS10泛素化位点鉴定 | uS10 K6/8R突变、uS3 K212R突变、Myc-泛素表达诱导条件（0.1 mM Cu2+ 2小时） 阅读提示：Methods 'Ribosome purification to identify the Rqt1 targets'；图1e |
| RQT复合物纯化 | Rqt2-FTP、Rqt3-3HA、Rqt4-3HA过表达条件、IgG beads和TEV切割、benzonase处理 阅读提示：Methods 'Purification of RQT complex'；图2d、e |
| 核糖体图谱分析 | RNase I消化条件（10 units，24°C 45分钟）、足迹长度（20–22 nt和27–29 nt）、A位点偏移量 阅读提示：Methods 'Ribosome profiling and data analysis'；图5b |
| 冷冻电镜数据采集 | 像素大小1.084 Å/pixel、累积剂量约28 e−/Å2、10帧、三维分类流程 阅读提示：Methods 'Cryo-EM analysis of Rqt1-ribosome complex and uL30 pullout'；图6 |
| 人类细胞敲低实验 | shRNA靶序列、慢病毒转导效率、K(AAA)24报告基因检测时间点 阅读提示：Methods 'Cell culture, lentiviral transduction, and transfection'；图7f、g |