构建Por条件敲除PIRF小鼠品系
获得可肝特异性删除Por且支持人肝细胞再殖的免疫缺陷小鼠。
通过基因打靶获得Por floxed小鼠，与FLPe小鼠交配去除筛选 cassette，再用CRISPR-Cas9同时敲除Il2rg、Rag2和Fah基因，获得PIRF品系。
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一种缺乏小鼠P450氧化还原酶的新型人源化小鼠用于研究人药物代谢
A novel humanized mouse lacking murine P450 oxidoreductase for studying human drug metabolism.
实验完整度
高包含基因敲除小鼠构建、人肝嵌合模型、RNA-Seq、蛋白检测及两种药物代谢物体内验证，具备功能与机制验证。
主要模型
PIRF小鼠（Porc/c/Il2rg−/−/Rag2−/−/Fah−/−） 人源化PIRF小鼠（Hu-PIRF） 人源化FRG小鼠（对照） 人原代肝细胞
重点核对
Adeno-Cre给药剂量2.2×10^10 pfu/小鼠，静脉注射，单次或两次（移植前和/或高嵌合后） 人肝细胞移植量3×10^6/小鼠，经脾脏注射，仅使用人嵌合率>70%的小鼠 吉非替尼10 mg/kg静脉注射，代谢笼收集16 h粪便 阿扎那韦30 mg/kg静脉注射，30 min后采集肝脏 RNA-Seq分析7只小鼠全部7个肝叶，每组3只动物（人源化组嵌合率>70%）
摘要
在研发中的药物只有十分之一能通过临床试验。许多失败是因为实验动物模型难以预测人体外源物代谢。人肝嵌合小鼠在这方面前进了一步，因为嵌合肝脏中的人肝细胞产生人代谢物，但残留的小鼠肝细胞含有扩展的P450细胞色素组，后者形成主要类别的药物代谢酶。因此，我们构建了NADPH-P450氧化还原酶（Por）基因的条件性敲除，并与Il2rg−/−/Rag2−/−/Fah−/−（PIRF）小鼠结合。在这里我们显示，纯合PIRF小鼠肝脏容易被人肝细胞再殖，并且当小鼠Por基因被删除（<5%）时，它们主要使用人细胞色素代谢。当给予抗癌药物吉非替尼或抗逆转录病毒药物阿扎那韦时，Por删除的人源化PIRF小鼠比当前模型产生更高水平的主要人代谢物。因此，人源化的小鼠Por缺陷PIRF小鼠可以预测人药物代谢，并应可用于临床前药物开发。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否构建一种小鼠模型，在保留人肝细胞再殖能力的同时消除小鼠P450细胞色素代谢干扰，从而更准确地预测人药物代谢？
- 核心机制
- 通过条件性敲除Por基因阻断小鼠P450细胞色素依赖的电子传递，使残留小鼠肝细胞的细胞色素代谢受抑，而移植的人肝细胞主要利用人细胞色素代谢药物。
- 主要证据
- 在PIRF小鼠中通过Adeno-Cre删除Por（<5%），人肝细胞再殖后，RNA-Seq显示小鼠细胞色素表达改变而人细胞色素稳健表达；给予吉非替尼后粪便中人主要代谢物M4和人特异性代谢物M28水平在Por删除人源化PIRF小鼠中最高；给予阿扎那韦后肝脏人代谢物M15水平为未删除小鼠的5.4倍。
- 研究意义
- 该模型可预测人药物代谢，有助于临床前药物开发中早期发现反应性代谢物并优化药物研发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Adeno-Cre介导小鼠Por基因删除
验证在PIRF小鼠肝脏中能否高效删除Por并抑制小鼠细胞色素代谢。
静脉注射Adeno-Cre，通过qRT-PCR、免疫组化和Western blot检测Por删除效率及肝脏脂质积累。
人肝细胞再殖PIRF小鼠
建立人源化PIRF小鼠并评估人肝嵌合率。
经脾脏注射人原代肝细胞，通过NTBC撤药施加选择压力，用ELISA检测人白蛋白以评估嵌合率。
比较Por删除前后小鼠和人细胞色素表达
验证Por删除对小鼠和人细胞色素表达谱的影响。
对Adeno-Cre或Adeno-GFP处理的人源化PIRF小鼠肝组织进行RNA-Seq，分析小鼠和人细胞色素表达。
吉非替尼代谢物体内分析
验证Por删除人源化PIRF小鼠是否产生更接近人的吉非替尼代谢物。
静脉注射吉非替尼，收集16 h粪便，用UHPLC-QTOFMS分析代谢物；部分实验分析血清和尿液。
阿扎那韦代谢物肝脏分析
验证Por删除人源化PIRF小鼠肝脏是否产生人主要阿扎那韦代谢物。
静脉注射阿扎那韦，30 min后取肝脏匀浆，用UHPLC-QTOFMS检测人主要代谢物M15。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
评估体内药物代谢
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Southern blot | DIG非同位素检测系统 | Roche Applied Biosciences | -- |
| CRISPR/Cas9载体构建 | DR274载体 | Addgene | 42250 |
| pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9载体 | Addgene | 42230 | |
| sgRNA体外转录 | MEGAshortscript T7转录试剂盒 | Life Technologies | AM1354 |
| RNA纯化 | RNA清洁与浓缩试剂盒-5 | Zymo | R1015 |
| Cas9 mRNA合成 | mMessage mMachine T7 ULTRA试剂盒 | life tech | AM1345 |
| qPCR | Purelink RNA微型试剂盒 | Invitrogen | -- |
| qScript cDNA预混液 | Quanta Biosciences | -- | |
| Perfecta SYBR Green快速预混液 | Quanta Biosciences | -- | |
| RNA-Seq文库构建 | TrueSeq链特异性mRNA LT试剂盒 | Illumina | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Sigma | R0278-50 ml |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | 04693159001 | |
| NuPAGE 4–12% Bis Tris凝胶 | Invitrogen | NP0336BOX | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| 兔抗Por抗体 | Abcam | ab13513 | |
| 小鼠抗β-actin抗体 | Sigma | A1978 | |
| 驴抗兔IgG/HRP | Jackson Immunoresearch Labs | 711-035-152 | |
| 驴抗小鼠IgG/HRP | Jackson Immunoresearch Labs | 711-035-150 | |
| Amersham ECL Western blot检测试剂 | General Electric Healthcare Life Sciences | RPN2106 | |
| 免疫组化 | 抗Por抗体 | Abcam | ab13513 |
| 抗人细胞核抗体 | EMD Millipore | MAB1281 | |
| Vectashield plus DAPI封片剂 | Vector Labs | -- | |
| 人白蛋白ELISA | 人白蛋白ELISA | Bethyl laboratories | -- |
| UHPLC-QTOFMS | 1260 Infinity二元液相色谱系统 | Agilent Technologies | -- |
| Agilent XDB C18色谱柱 | Agilent | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Adeno-Cre介导Por删除 | Adeno-Cre剂量2.2×10^10 pfu/小鼠，静脉注射，单次或两次（移植前和/或高嵌合后）；Por删除效率<5% 阅读提示：Methods中Humanization of PIRF mice小节及Fig. 1b–d、Fig. 3a |
| 人肝细胞移植与嵌合率 | 人肝细胞3×10^6/小鼠经脾注射；NTBC撤药方案；仅使用人嵌合率>70%的小鼠 阅读提示：Methods中Humanization of PIRF mice小节 |
| 吉非替尼代谢物分析 | 吉非替尼10 mg/kg静脉注射；16 h粪便收集；每组3只动物，人源化组嵌合率>70% 阅读提示：Methods中Sample preparation for mass spectrometry小节及Fig. 4c |
| 阿扎那韦代谢物分析 | 阿扎那韦30 mg/kg静脉注射；30 min后采集肝脏；肝匀浆制备比例 阅读提示：Methods中Sample preparation for mass spectrometry小节及Fig. 4f |
| RNA-Seq分析 | Adeno-Cre或Adeno-GFP 2.2×10^10 pfu/小鼠；1周后取全部7个肝叶；N=7只小鼠 阅读提示：Methods中RNA-Seq libraries小节及Fig. 3b |