DNA replication licensing factor Cdc6 and Plk4 kinase antagonistically regulate centrosome duplication via Sas-6.
包含细胞系体外实验、活细胞成像、超分辨定位、蛋白互作、体外激酶实验及磷酸化突变体功能验证等多个独立证据层级。
U2OS细胞 HEK293细胞 HeLa细胞
Cdc6 siRNA（5′-AACUUCCCACCUUAUACCAGA-3′）和Cdc6 siRNA-2（5′-AAGAAUCUGCAUGUGUGAGAC-3′）敲低效率及表型 HU处理：16 mM HU处理52 h诱导中心粒扩增 Plk4磷酸化Cdc6的位点：S30和T527，使用Phos-Tag丙烯酰胺实验和体外激酶实验验证 Cdc6 2A（S30A, T527A）和2D（S30D, T527D）突变体功能差异 免疫荧光计数：每样本约100–300个细胞，三次独立实验，Student's t-test
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定Cdc6是否定位到中心体以及其定位机制。
通过免疫荧光观察内源Cdc6在S和G2期定位到中心粒近端侧；用GFP-Cdc6 WT、WA（K208E）和WB（E285G）突变体转染U2OS细胞，发现WA突变体不能定位到中心粒；通过体外蛋白结合实验和co-IP验证Cdc6与cyclin A的相互作用；使用Cdc6 Δcy突变体和cyclin A CLS片段过表达实验验证cyclin A对Cdc6中心体定位的必要性。
验证Cdc6是否负调控中心体复制。
用Cdc6 siRNA敲低内源Cdc6，通过γ-tubulin和centrin1染色计数中心体和中心粒数目；在HU处理条件下过表达GFP-Cdc6 WT、WA、WB、Δcy及Plk4CTS-Cdc6 Δcy融合蛋白，计数中心粒扩增细胞比例；在正常细胞周期中过表达GFP-Cdc6 50 h，计数中心粒数目。
确定Cdc6与中心体复制核心蛋白的时空关系和相互作用。
通过共转染和免疫荧光观察Cdc6与Plk4、Sas-6、STIL的共定位，使用3D-SIM和STED超分辨显微镜；通过co-IP验证内源Cdc6与Plk4、Sas-6的相互作用；通过体外蛋白结合实验验证Cdc6与Plk4、Sas-6的直接结合；通过co-IP检测Cdc6与Plk4相互作用的细胞周期依赖性及Cdc6截短体与Plk4的结合区域。
确定Plk4是否磷酸化Cdc6以及磷酸化位点，并验证磷酸化对Cdc6功能的影响。
使用GPS 3.0预测Plk4磷酸化位点，通过Phos-Tag丙烯酰胺实验检测细胞内Cdc6 WT、S30A、T527A、2A突变体的磷酸化；通过体外激酶实验用纯化的GST-Plk4和His-Cdc6及突变体与[γ-32P]-ATP孵育检测磷酸化；在HU处理或Plk4过表达条件下过表达Cdc6 WT、2A、2D突变体，计数中心粒扩增。
探究Cdc6磷酸化如何调控Sas-6与STIL的相互作用。
通过体外蛋白结合实验，将His-Cdc6 WT、2A、2D与GST-Plk4共孵育后，检测其与His-Sas-6的结合；进一步检测Cdc6磷酸化对HA-Sas-6与HA-STIL相互作用的影响；通过co-IP检测细胞内Cdc6 WT、2A、2D与Sas-6的相互作用强度；通过双敲低Cdc6和Sas-6验证Sas-6在Cdc6下游的作用。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | GIBCO | -- |
| 细胞周期同步 | 胸苷 | Sigma | -- |
| 诱导中心粒扩增 | 羟基脲 | Sigma | H8627 |
| 质粒DNA转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 免疫荧光 | 小鼠抗Cdc6抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-13136 |
| 小鼠抗Sas-6抗体 | Santa Cruz | sc-81431 | |
| 兔抗centrin1抗体 | Proteintech | 12794-1-AP | |
| 兔抗γ-微管蛋白抗体 | Sigma | T3559 | |
| 兔抗CP110抗体 | Santa Cruz | sc-136629 | |
| 兔抗Cep97抗体 | Bethyl | A301-945A | |
| 兔抗STIL抗体 | Abcam | ab89314 | |
| 兔抗Cep164抗体 | Proteintech | 22227-1-AP | |
| 免疫共沉淀 | 琼脂糖珠偶联小鼠抗HA抗体 | CMCTAG | AT0079 |
| Western blot | 小鼠抗GFP抗体 | Santa Cruz | sc-9996 |
| 小鼠抗Myc抗体 | Sigma | M4439 | |
| 小鼠抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 兔抗cyclin A抗体 | Santa Cruz | sc-751 | |
| 兔抗HA抗体 | Sigma | H6908 | |
| 兔抗GST抗体 | Santa Cruz | sc-459 | |
| 兔抗磷酸丝氨酸抗体 | Abcam | ab9332 | |
| 蛋白纯化 | His60镍超流树脂 | -- | -- |
| 谷胱甘肽Sepharose 4B珠 | GE Healthcare | -- | |
| 体外转录翻译 | 快速偶联转录/翻译系统 | Promega | L1170 |
| 体外激酶实验 | [γ-32P]-ATP | -- | -- |
| 免疫荧光 | 含1 μg/ml DAPI的mowiol封片剂 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Cdc6敲低与中心体复制表型 | Cdc6 siRNA序列（5′-AACUUCCCACCUUAUACCAGA-3′和5′-AAGAAUCUGCAUGUGUGAGAC-3′）、siRNA浓度0.2 μM、转染后72 h固定、细胞系U2OS 阅读提示：Methods中Plasmid DNA transfection and RNA interference小节；Figure 2a,b及Supplementary Fig. 2a |
| HU诱导中心粒扩增及Cdc6过表达抑制 | HU浓度16 mM、处理时间52 h、转染后4 h开始HU处理、细胞系U2OS、计数约100–300个细胞/样本、三次独立实验 阅读提示：Methods中HU induced centriole amplification assay小节；Figure 2c–f、Figure 5a,b |
| Plk4磷酸化Cdc6位点鉴定 | Cdc6突变体S30A、T527A、2A（S30A/T527A）、2D（S30D/T527D）构建；Phos-Tag丙烯酰胺实验；体外激酶实验使用约2 μg Cdc6与1 μg GST-Plk4、30°C 30 min、10 μCi [γ-32P]-ATP 阅读提示：Methods中In vitro kinase activity assays小节；Figure 4f–h；Supplementary Fig. 4d–g |
| Cdc6与Sas-6、STIL相互作用及磷酸化调控 | 体外翻译His-Cdc6、2A、2D、His-Sas-6、HA-STIL；GST-Plk4激酶反应条件（30°C 30 min，200 μM ATP）；co-IP抗体用量约2 μg；细胞系HEK293 阅读提示：Methods中In vitro protein interaction assay小节；Figure 6b、Figure 7c,d；Supplementary Fig. 7 |
| 细胞周期同步与Plk4-Cdc6互作S期特异性 | 双胸苷阻断：2.5 mM胸苷处理16 h，释放10 h，再次2.5 mM胸苷16 h；释放3或6 h为早/晚S期，8或10 h为早/晚G2期；细胞系HeLa 阅读提示：Methods中Cell culture and cell cycle synchronization小节；Figure 4d |
| 超分辨共定位分析 | 3D-SIM使用Nikon N-SIM，100×/1.49 NA油镜，405/488/561/640 nm激光，0.84 μm间隔；STED使用Leica TCS SP8 STED 3×，100×/1.40 NA油镜，488 nm激发/592 nm损耗（绿），592 nm激发/775 nm损耗（红） 阅读提示：Methods中Super resolution microscopy小节；Figure 3b–g |
