LPP敲低对乳腺肿瘤生长和肺转移的影响
验证LPP在体内是否影响原发肿瘤生长和肺转移
在NMuMG-ErbB2和NIC细胞中稳定敲低LPP，注射入小鼠乳腺脂肪垫，监测肿瘤生长，切除原发瘤后计数肺表面转移灶和H&E肺转移面积
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LPP是invadopodia形成和高效乳腺癌肺转移所需的Src底物
LPP is a Src substrate required for invadopodia formation and efficient breast cancer lung metastasis.
实验完整度
高含体外细胞系、CAM活体成像、小鼠乳腺脂肪垫和尾静脉注射模型，并做结构域与磷酸化位点功能验证
主要模型
NMuMG-ErbB2小鼠乳腺癌细胞 NIC小鼠乳腺癌细胞 HCC1954人乳腺癌细胞 NCr裸鼠及ex ovo鸡胚CAM模型
重点核对
LPP-shRNA与LucA-shRNA对照在NMuMG-ErbB2和NIC细胞中的敲低效果 TGFβ1处理浓度2 ng/ml及24–48 h时间 小鼠乳腺脂肪垫注射细胞数（7.5×10^5 NMuMG-ErbB2、3.5×10^5 NIC）及每组n=10 尾静脉注射2×10^5 NMuMG-ErbB2细胞及多西环素2 mg/ml饮水诱导 LPP磷酸化位点突变体Y245/301/302F对侵袭和转移的验证
摘要
我们此前已证明，脂肪瘤首选伴侣蛋白（LPP）介导TGFβ诱导的乳腺癌细胞迁移和侵袭。在此，我们证明降低LPP表达会减少循环肿瘤细胞数量、损害癌细胞外渗并减少肺转移。通过鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）活体成像揭示，LPP与Tks5/肌动蛋白一起定位于invadopodia，即基质降解位点，也定位于正在外渗的乳腺癌细胞尖端。Invadopodia形成、乳腺癌细胞外渗和转移需要完整的LPP LIM结构域以及LPP与α-actinin相互作用的能力。最后，我们证明Src介导的LPP在特定酪氨酸残基（Y245/301/302）上的磷酸化对invadopodia形成、乳腺癌细胞侵袭和转移至关重要。总之，这些数据定义了LPP在invadopodia形成中此前未知的功能，并揭示LPP在介导乳腺癌细胞转移能力中的必要性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LPP是否作为Src底物调控invadopodia形成，并影响乳腺癌细胞intravasation、extravasation和肺转移？
- 核心机制
- Src介导LPP在Y245/301/302位点磷酸化，且LPP通过完整LIM1结构域和α-actinin结合域定位于invadopodia并促进其形成，从而增强乳腺癌细胞侵袭和转移。
- 主要证据
- NMuMG-ErbB2和NIC细胞LPP敲低减少CTC和肺转移；HCC1954和NMuMG-ErbB2明胶降解实验显示LPP缺失或LIM1/ABD突变体降低invadopodia形成；CAM活体成像显示LPP与Tks5/actin共定位并促进外渗；Src抑制或敲低降低LPP酪氨酸磷酸化，LPP-5F及Y245/301/302F突变体不能恢复侵袭和转移。
- 研究意义
- 揭示了LPP在invadopodia形成中的新功能，并表明LPP是介导乳腺癌细胞转移能力的重要分子。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LPP对循环肿瘤细胞和intravasation的影响
验证LPP是否影响肿瘤细胞进入血液循环
从荷瘤小鼠心脏采血，Ficoll分离单个核细胞，用嘌呤霉素筛选培养2周，计数CTC来源黏附集落
LPP对invadopodia形成和基质降解的影响
验证LPP及LIM1/ABD结构域是否影响invadopodia介导的明胶降解
HCC1954和NMuMG-ErbB2细胞TGFβ处理后铺于荧光明胶，固定染色Tks5、F-actin和LPP，定量明胶降解面积
LPP与Tks5/actin在invadopodia中的共定位
验证LPP是否定位于活性invadopodia
TGFβ处理细胞铺于Alexa 405明胶，染色LPP、Tks5和F-actin，共聚焦成像、线扫描和Z-stack正交视图分析
LPP对MMP表达和活性的影响
判断LPP缺失导致明胶降解减少是否源于MMP表达或分泌缺陷
检测TGFβ处理前后MMP2、MMP9、MMP14的mRNA表达，并用明胶酶谱检测条件培养基中MMP2/MMP9活性
LPP结构域对CAM外渗的影响
在活体成像中验证LPP及LIM1/ABD结构域对外渗的作用
将表达eGFP-LPP-WT、mLIM1或ΔABD的NMuMG-ErbB2细胞静脉注射入14 dpf鸡胚CAM，A647-lectin标记内皮，4 h后计数血管外细胞比例
Src对LPP酪氨酸磷酸化的调控
验证Src是否是TGFβ诱导LPP酪氨酸磷酸化所必需和充分的激酶
在NMuMG-ErbB2、NIC、HCC1954、BT549中用SFK抑制剂Dasatinib和PP2、Src-shRNA、组成型激活Src-Y529F以及NIC;Src+/+与NIC;Srcfl/fl细胞检测LPP免疫沉淀后的磷酸酪氨酸水平
LPP磷酸化位点对迁移、侵袭和invadopodia的功能验证
确定LPP酪氨酸磷酸化及具体位点对迁移、侵袭和明胶降解的作用
构建eGFP-LPP-5F及Y245F、Y297/298F、Y301/302F等突变体，在LPP-shRNA NMuMG-ErbB2中回补，进行Boyden小室迁移侵袭实验和明胶降解实验
LPP磷酸化位点对体内转移的影响
验证Y245/301/302磷酸化位点对CTC和肺转移的作用
将表达LPP-WT、LPP-245F、LPP-C、LPP-D的NMuMG-ErbB2细胞注射入小鼠乳腺脂肪垫，检测肿瘤生长、CTC和肺转移灶
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证亚细胞定位
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 多西环素 | Sigma-Aldrich | D9891 |
| 转化生长因子β1 | Peprotech | 100-21 | |
| MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | LT07-318 | |
| 胶原酶B | -- | -- | |
| 中性蛋白酶II | -- | -- | |
| Retro-X通用包装系统 | Clontech | 631530 | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 载体构建 | SIN-TREmiR30-PIG (TMP)载体系统 | Open Biosystems | EAV4678 |
| MSCV-LTRmiR30-PIG (LMP)载体系统 | Open Biosystems | EAV4071 | |
| QuikChange定点突变试剂盒 | Stratagene | 210518 | |
| siRNA转染 | INTERFERrin转染试剂 | Polyplus transfection | 409-50 |
| 载体构建 | pUSE src-529F质粒 | Upstate Biotechnology | 21-115 |
| RNA提取与RT-qPCR | QIA shredder柱 | Qiagen | 79656 |
| RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74106 | |
| 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368813 | |
| FastStart通用SYBR Green预混液 | Roche | 04913914001 | |
| Rotor-gene RG-3000 PCR仪 | Corbett Research | -- | |
| 增殖实验 | xCELLigence E-板 | Roche Applied Science | 05469813001 |
| RTCA DP分析仪 | Roche Applied Science | -- | |
| 免疫印迹 | 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | IPVH00010 |
| LPP抗体 | Cell Signaling | 3389 | |
| ErbB2抗体 | Santa Cruz | SC-284 | |
| E-钙黏蛋白抗体 | Sigma | U3254 | |
| 纤连蛋白抗体 | Sigma | F3648 | |
| 波形蛋白抗体 | BD Biosciences | 550513 | |
| α-SMA抗体 | Sigma | A2547 | |
| 磷酸化Smad2抗体 | Cell Signaling | 3101 | |
| Smad2/3抗体 | Cell Signaling | 3102 | |
| Snail抗体 | Cell Signaling | 3895 | |
| 4G10铂金抗磷酸酪氨酸抗体 | Millipore | 05-1050 | |
| 磷酸化Src家族Tyr416抗体 | Cell Signaling | 2101 S | |
| Src抗体（克隆GD11） | Millipore | 05-184 | |
| 磷酸化FAK Tyr397抗体 | Cell Signaling | 3283 | |
| 磷酸化FAK Tyr576/577抗体 | Cell Signaling | 3281 | |
| 磷酸化FAK Tyr925抗体 | Santa Cruz | sc-11766 R | |
| FAK抗体 | Millipore | 06-543 | |
| α-微管蛋白抗体 | Sigma | T9026 | |
| Pierce增强化学发光底物 | Thermo Scientific | 32106 | |
| 明胶降解实验 | Alexa 405染料 | ThermoFisher Scientific | A30000 |
| 明胶 | Bioshop | GEL771 | |
| Bio-Gel P-30 | Bio-Rad | 150-4154 | |
| 多聚-D-赖氨酸 | Sigma | P6407 | |
| 纤连蛋白 | Millipore | FC010 | |
| Oregon Green 488偶联明胶 | Invitrogen | G13186 | |
| 未偶联明胶 | Stem Cell Technologies | 07903 | |
| 免疫荧光染色 | Tks5/FISH抗体 | Santa Cruz | sc-30122 |
| F-肌动蛋白/鬼笔环肽 | ThermoFisher Scientific | A22287 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| Immu-Mount封片剂 | Thermo scientific | 9990402 | |
| 动物实验 | 基质胶 | BD Biosciences | 354234 |
| 多西环素 | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| 免疫组织化学 | 抗LPP抗体（EPR6478） | abcam | ab126608 |
| 抗c-ErbB2抗体 | Dako | A0485 | |
| 循环肿瘤细胞分离 | EDTA微量采血管 | Sarstedt | 41.1395.105 |
| Ficoll-Paque Plus分离液 | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| BD Pharm Lyse红细胞裂解液 | BD | 555899 | |
| 迁移和侵袭实验 | Boyden小室 | BD Falcon | 35-3097 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| LPP敲低与对照细胞构建 | shRNA序列、敲低效率及LucA-shRNA对照；LPP-shRNA靶向3′-UTR用于回补实验 阅读提示：Methods的DNA constructs and siRNA小节及Supplementary Fig. 1 |
| TGFβ刺激与细胞培养 | TGFβ1浓度2 ng/ml、处理时间24–48 h；多西环素1 μg/ml预处理至少96 h 阅读提示：Methods的Cell culture小节 |
| 乳腺脂肪垫注射与肺转移分析 | 细胞数量、每组n=10、肿瘤切除体积、取材时间及肺转移定量方法 阅读提示：Methods的Mammary fat pad and tail vein injections与Histology and immunohistochemistry小节，Fig. 1及Fig. 10图注 |
| 尾静脉注射与多西环素诱导 | 尾静脉注射2×10^5细胞；多西环素2 mg/ml饮水，注射前1周开始并维持 阅读提示：Methods的Mammary fat pad and tail vein injections小节及Fig. 6图注 |
| 明胶降解与invadopodia成像 | 明胶包被浓度、细胞数30,000、TGFβ预处理24 h及铺板24 h；LPP/Tks5/phalloidin抗体稀释比例 阅读提示：Methods的Gelatin degradation assay and immunofluorescence staining小节及Fig. 3、Fig. 4图注 |
| CAM外渗实验 | 14 dpf鸡胚、注射5×10^6细胞、每组n≥3、每细胞系≥500细胞及lectin-A647标记 阅读提示：Methods的Ex ovo chick chorioallantoic membrane assay小节及Fig. 5图注 |
| LPP磷酸化位点突变体功能验证 | Y245、Y297/298、Y301/302突变为苯丙氨酸的组合方式及回补表达水平 阅读提示：Methods的DNA constructs and siRNA小节及Fig. 8、Fig. 9图注 |
| 统计学设计 | 体外实验至少3次独立实验；体内每组n=10基于效能分析；两样本不等方差t检验 阅读提示：Methods的Statistical analysis小节 |