构建p21-GFP和mRuby-PCNA标记细胞系
实现活细胞中p21蛋白水平和细胞周期阶段的同步追踪。
利用CRISPR介导的基因敲入在hTert-RPE1细胞CDKN1A基因C端标记GFP，并在已有mRuby-PCNA标记细胞系中进行。
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S期DNA损伤通过p21表达介导随后的G1期增殖-静息决定
DNA damage during S-phase mediates the proliferation-quiescence decision in the subsequent G1 via p21 expression.
实验完整度
高体外细胞模型活单细胞成像、CRISPR敲除/敲入、免疫印迹、免疫荧光、流式及数学建模等多层验证。
主要模型
hTert-RPE1细胞系（mRuby-PCNA和p21-GFP标记） hTert-RPE1 p21敲除细胞系（p21KO1和p21KO2） hTert-RPE1 CDK2活性报告细胞系 hTert-RPE1 53BP1-GFP/mRuby稳定细胞系
重点核对
p21-GFP敲入hTert-RPE1细胞中p21功能保留验证（结合CDK2、高血清下G1期阻滞） p53或p21 siRNA敲低效率及表型验证（G1pm阻滞比例、G1期长度分布） CRISPR/Cas9 p21敲除克隆的基因型及p21表达缺失验证 活细胞成像中488 nm激光曝光不诱导p21-GFP表达的对照验证 aphidicolin或ATRi处理下γH2AX焦点数、p53表达及p21-GFP动态检测
摘要
由电离辐射等外源性因素引起的DNA损伤后，肿瘤抑制因子p53通过表达CDK抑制剂p21介导细胞周期阻滞。然而，在无外源性DNA损伤剂的情况下，p21在维持基因组稳定性中的作用尚不清楚。在此，利用增殖培养物中p21蛋白的活单细胞测量，我们展示S期积累的天然DNA损伤导致母细胞G2期和子细胞G1期p53依赖性的p21积累。高p21水平通过CDK抑制介导G1期阻滞，而较低水平对G1期进程没有影响，且泛素连接酶CRL4Cdt2和SCFSkp2偶联在G1/S转换前降解p21。数学建模揭示，由CRL4Cdt2产生的双稳态开关通过保持p21水平较低来促进不可逆的S期进入，防止DNA损伤时过早的S期退出。因此，我们表征了p21如何调控增殖-静息决定以维持基因组稳定性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在无外源性DNA损伤剂的情况下，p21如何调控增殖-静息决定并维持基因组稳定性？
- 核心机制
- S期发生的天然DNA损伤通过p53依赖性途径诱导p21在母细胞G2期和子细胞G1期积累；高p21水平抑制CDK2活性导致G1pm阻滞，而CRL4Cdt2和SCFSkp2在G1/S转换前以不同速率降解p21，CRL4Cdt2介导的双稳态开关确保S期进入不可逆。
- 主要证据
- 活单细胞成像显示p21-GFP水平异质性与G1期长度相关，p53敲低消除p21异质性和G1pm阻滞；p21敲低/敲除减少G1pm阻滞但不改变G1期长度；γH2AX、53BP1焦点与p21表达相关；aphidicolin和ATRi处理增加p21表达和G1/G2期阻滞；Skp2和Cdt2敲低实验结合数学建模验证双稳态开关。
- 研究意义
- 表征了p21如何调控增殖-静息决定以维持基因组稳定性，提出p21作为p53活性读数并在S期后重置信息以允许细胞对DNA损伤做出增殖或静息决定。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
活单细胞成像测量p21-GFP动态与细胞周期
量化未扰动细胞中p21-GFP的细胞间和细胞内变异及其与细胞周期阶段的关系。
在Opera HC转盘共聚焦显微镜下对异步hTert-RPE1 mRuby-PCNA p21-GFP细胞进行延时成像，追踪p21-GFP和PCNA信号。
p53和p21敲低/敲除验证p21异质性和G1pm阻滞依赖性
确定p53和p21在p21异质性及G1pm阻滞中的作用。
使用siRNA敲低p53或p21，并利用CRISPR/Cas9生成p21KO细胞系，通过活细胞成像和FACS分析G1pm阻滞比例和G1期长度。
检测DNA损伤焦点与p21表达的相关性
验证内源性DNA损伤是否与p21表达及G1pm阻滞相关。
对未扰动hTert-RPE1细胞进行γH2AX、53BP1、PS1981-ATM和RPA2免疫染色，并结合活细胞成像追踪53BP1-GFP焦点。
aphidicolin和ATRi处理诱导S期DNA损伤
检验S期DNA复制受损能否诱导p21表达和细胞周期阻滞。
用低剂量aphidicolin或ATR抑制剂AZD6738处理异步细胞，活细胞成像追踪p21-GFP和CDK2活性，并计数γH2AX焦点。
Skp2和Cdt2敲低分析p21降解途径
确定SCFSkp2和CRL4Cdt2在p21降解中的相对贡献和时序。
siRNA敲低Skp2、Cdt2或两者联合，活细胞成像追踪p21-GFP在G1/S转换和S期的动态。
数学建模p21调控网络
解释p21动态并预测双稳态开关行为。
基于 wiring diagram 构建非线性常微分方程模型和随机模拟，模拟Skp2和Cdt2敲低效应。
血清饥饿诱导G1pm阻滞及p21依赖性验证
检验血清饥饿引起的G1pm阻滞是否依赖p21。
无血清培养hTert-RPE1 p21-GFP细胞，活细胞成像追踪p21-GFP；FACS分析WT和p21KO细胞在血清撤除后的细胞周期。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 活细胞成像 | 488 nm激光功率20%，曝光时间120 ms；成像间隔10分钟；温度37°C、5% CO2、80%湿度；细胞接种密度1,000细胞/孔 阅读提示：Methods中Live cell imaging和Testing 488 nm exposures for live imaging小节 |
| p21-GFP敲入细胞系构建 | gRNA序列、同源臂引物、转染试剂Lipofectamine 2000、FACS分选策略、克隆扩增时间 阅读提示：Methods中Generating p21-GFP-tagged hTert-RPE1 cell lines小节及Supplementary Fig. 1 |
| siRNA敲低 | siRNA终浓度20 nM，Lipofectamine RNAiMax用量，转染时间（成像前24小时或6小时） 阅读提示：Methods中siRNA transfection小节 |
| 药物处理 | aphidicolin浓度0.3 μM或0.6 μM，ATRi浓度0.5 μM或1 μM，Nutlin-3浓度5 μM，处理时间24小时（焦点计数）或急性处理（活细胞成像） 阅读提示：Methods中Inhibitors小节及Figure 4图注 |
| 免疫染色 | 固定液8%甲醛5分钟37°C，透化0.2% TritonX-100 5分钟室温，一抗稀释度（p21 1:1,000，γH2AX 1:2,000，53BP1 1:1,000，PS1981-ATM 1:500，RPA2 1:250） 阅读提示：Methods中Immunostaining小节 |
| 数学建模 | 模型参数值、初始条件、随机模拟设置、Skp2和Cdt2敲低模拟降至1% 阅读提示：Methods中Mathematical modelling小节及Supplementary Tables 3和4 |