患者来源细胞中CH25H和25-HC的鉴定
探究CCALD的炎症表型相关分子机制。
对hESCs、对照、AMN和CCALD-iPSCs进行微阵列转录谱分析，并通过qRT-PCR和GC-MS验证CH25H mRNA和25-HC水平。
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25-羟基胆固醇通过激活NLRP3炎症小体参与X连锁肾上腺脑白质营养不良的脑部炎症
25-hydroxycholesterol contributes to cerebral inflammation of X-linked adrenoleukodystrophy through activation of the NLRP3 inflammasome.
实验完整度
高包含患者来源iPSCs和成纤维细胞、小鼠原代细胞、NLRP3敲除小鼠及脑内立体定位注射等多层次模型，并进行了功能与机制验证。
主要模型
CCALD患者来源的iPSCs及分化的少突胶质前体细胞 CCALD患者来源的成纤维细胞 小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）和小胶质细胞 Nlrp3+/+和Nlrp3−/−小鼠脑内立体定位注射模型
重点核对
CCALD患者来源细胞中CH25H mRNA和25-HC水平升高 25-HC而非VLCFA在LPS存在下诱导BMDMs和微胶质细胞中caspase-1活化和IL-1β分泌 25-HC诱导NLRP3-ASC组装和ASC寡聚化，且在Nlrp3−/−细胞中反应消失 25-HC激活NLRP3炎症小体依赖于钾外流、线粒体ROS和LXR信号 小鼠脑内注射25-HC诱导小胶质细胞募集和少突胶质细胞凋亡，且依赖于NLRP3
摘要
X连锁肾上腺脑白质营养不良（X-ALD）由ABCD1突变引起，是一种进行性神经退行性疾病，与极长链脂肪酸（VLCFA）的积累相关。脑部炎性脱髓鞘是儿童脑型ALD（CCALD）的主要特征，CCALD是ALD最严重的形式，但其潜在机制仍知之甚少。在此，我们基于对ALD患者来源的诱导多能干细胞和离体成纤维细胞的分析，在CCALD的细胞环境中发现了胆固醇25-羟化酶（CH25H）和25-羟基胆固醇（25-HC）的异常产生。有趣的是，25-HC而非VLCFA，通过钾外流、线粒体活性氧（ROS）和肝X受体（LXR）介导的途径促进强烈的NLRP3炎症小体组装和激活。此外，将25-HC立体定位注射到小鼠大脑胼胝体，以NLRP3炎症小体依赖的方式诱导小胶质细胞募集、白细胞介素-1β产生和少突胶质细胞死亡。总之，我们的结果表明，25-HC通过激活NLRP3炎症小体介导X-ALD的神经炎症。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- X-ALD中脑部炎症的启动机制尚不清楚，VLCFA积累是否以及如何导致神经炎症有待阐明。
- 核心机制
- 25-HC通过钾外流、线粒体ROS和LXR介导的途径促进NLRP3炎症小体组装和活化，进而导致小胶质细胞募集、IL-1β产生和少突胶质细胞死亡。
- 主要证据
- 利用CCALD患者来源的iPSCs和成纤维细胞发现CH25H和25-HC升高；在BMDMs、微胶质细胞和THP-1细胞中验证25-HC激活NLRP3炎症小体；小鼠脑内立体定位注射25-HC诱导炎症反应，且在Nlrp3−/−小鼠中减弱。
- 研究意义
- 结果表明25-HC介导X-ALD的神经炎症，靶向NLRP3炎症小体可能为X-ALD治疗提供临床益处。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ABCD1缺陷对CH25H表达的调控
确定ABCD1功能缺陷是否参与CH25H表达的诱导。
在对照成纤维细胞中用siRNA敲低ABCD1，在CCALD成纤维细胞中过表达ABCD1，检测VLCFA水平和CH25H mRNA；并在Abcd1缺陷小鼠脑匀浆中检测Ch25h表达。
25-HC在小鼠脑内诱导小胶质细胞募集和IL-1β产生
验证25-HC是否介导脑部炎症。
将25-HC立体定位注射到野生型小鼠胼胝体，检测Iba-1阳性小胶质细胞、IL-1β水平以及活性caspase-1。
25-HC激活NLRP3炎症小体的体外验证
确定25-HC是否激活NLRP3炎症小体。
在BMDMs、微胶质细胞、混合胶质细胞和THP-1细胞中，用25-HC和LPS处理，检测caspase-1活化、IL-1β分泌、ASC寡聚化和NLRP3-ASC组装；利用Nlrp3−/−细胞验证依赖性。
25-HC激活NLRP3炎症小体的分子机制
探究25-HC激活NLRP3的分子途径。
使用钾外流抑制剂（格列本脲、高钾）、线粒体ROS清除剂（Mito-TEMPO、NAC）和LXR拮抗剂（22(S)-HC）处理，检测caspase-1活化和ASC寡聚化。
NLRP3缺陷对25-HC诱导脑部炎症的影响
验证NLRP3炎症小体在25-HC诱导脑部炎症中的作用。
在Nlrp3+/+和Nlrp3−/−小鼠脑内注射25-HC，检测小胶质细胞募集、IL-1β产生和少突胶质细胞凋亡；使用IL-1Ra验证IL-1β的作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | L929条件培养基 | -- | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| DMEM/F-12培养基 | -- | -- | |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| RNeasy迷你试剂盒 | Intron | -- | |
| Trizol试剂 | Invitrogen | -- | |
| qRT-PCR | SYBR Premix Ex Taq | Takara | -- |
| 细胞毒性检测 | CytoTox96非放射性细胞毒性检测试剂盒 | Promega | -- |
| 免疫荧光 | 抗Iba-1抗体 | Wako | 019-19741 |
| 抗MBP抗体 | Abcam | ab7349 | |
| 抗cleaved caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| Alexa Fluor 488或594标记的二抗 | Molecular Probes | -- | |
| 免疫印迹 | 抗小鼠caspase-1抗体 | Adipogen | AG-20B-0042 |
| 抗小鼠IL-1β抗体 | R&D | AF-401-NA | |
| 抗人caspase-1抗体 | Santa Cruz | SC-515 | |
| 抗人IL-1β抗体 | Cell Signaling | 2022 | |
| 抗小鼠NLRP3抗体 | Adipogen | AG-20B-0014 | |
| 抗小鼠ASC抗体 | Santa Cruz | SC-22514-R | |
| ELISA | 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | R&D | -- |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | R&D | -- | |
| 细胞因子检测 | CBA小鼠炎症试剂盒 | BD | -- |
| caspase-1活性检测 | FAM-FLICA-caspase-1检测试剂盒 | ImmunoChemistry | -- |
| 邻近连接分析 | Duolink原位红色起始试剂盒 | Sigma | -- |
| 线粒体ROS检测 | MitoSOX线粒体超氧化物指示剂 | Invitrogen | -- |
| 线粒体膜电位检测 | MitoTracker深红色线粒体染料 | Invitrogen | -- |
| MitoTracker绿色线粒体染料 | Invitrogen | -- | |
| 立体定位注射 | 重组人IL-1受体拮抗剂 | Prospec | -- |
| 立体定位仪 | Stoelting | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者来源细胞中CH25H和25-HC的检测 | 细胞类型（iPSCs、成纤维细胞、OPCs）、培养代数、qRT-PCR引物序列、GC-MS方法 阅读提示：Methods中'Establishment of X-ALD patients-derived cells'和'Measurement of VLCFA and 25-HC'小节，以及Figure 1图注 |
| ABCD1敲低和过表达实验 | siRNA序列、转染试剂、慢病毒载体、VLCFA处理浓度和时间 阅读提示：Methods中'ABCD1 expression'小节和Figure 2图注 |
| 25-HC立体定位注射 | 25-HC浓度（100 μM）、注射坐标、对照（vehicle）、注射后时间（3天）、小鼠品系和年龄 阅读提示：Methods中'Stereotaxic injection'小节和Figure 3图注 |
| NLRP3炎症小体激活实验 | 25-HC浓度范围（1-100 μM）、LPS浓度（0.25 μg/ml）和处理时间、细胞类型（BMDMs、微胶质细胞、THP-1） 阅读提示：Methods中'Assay of inflammasome/caspase-1 activation'小节和Figure 4图注 |
| 机制验证实验 | 抑制剂浓度（格列本脲50 μM、KCl 20 mM、NAC 20 mM、Mito-TEMPO 200 μM、22(S)-HC 50或100 μM）和处理时间 阅读提示：Methods中相关小节和Figure 5图注 |
| Nlrp3−/−小鼠实验 | 小鼠来源（The Jackson Laboratory）、背景（C57BL/6）、年龄（7-10周）、性别（雄性） 阅读提示：Methods中'Mice'小节和Figure 6图注 |