药理学抑制PKM2对炎症小体活化的影响
验证PKM2抑制剂shikonin是否选择性影响不同炎症小体活化。
在LPS预处理的BMDMs、PMA分化的THP1细胞和PMs中，用ATP、poly(dA:dT)、MDP或flagellin刺激，并给予shikonin，检测IL-1β、IL-18、HMGB1释放和caspase-1活性。
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PKM2依赖的糖酵解促进NLRP3和AIM2炎症小体活化
PKM2-dependent glycolysis promotes NLRP3 and AIM2 inflammasome activation.
实验完整度
高含体外巨噬细胞模型、基因敲除/敲低、体内内毒素血症和CLP脓毒症模型及生存分析，具备功能与机制验证。
主要模型
小鼠原代骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） 小鼠腹腔巨噬细胞（PMs） PMA分化的THP1细胞 髓系细胞特异性PKM2敲除小鼠（LPS/ATP或LPS/nucleosome模型）
重点核对
LPS（500 ng/ml，3 h）预处理后，ATP（5 mM，30 min）或poly(dA:dT)（1 μg/ml，8 h）刺激，以MDP（200 ng/ml，8 h）或flagellin（200 ng/ml，8 h）作为对照 PKM2药理学抑制使用shikonin（1和5 μM），遗传学抑制使用PKM2特异性shRNA EIF2AK2抑制使用C16（1和5 μM）或EIF2AK2特异性shRNA 体内内毒素血症模型：LPS 5 mg/kg腹腔注射；CLP诱导多微生物脓毒症 髓系PKM2敲除小鼠：LPS（2 mg/kg）预处理3 h后，腹腔注射ATP（200 mg/kg）或nucleosome（20 mg/kg）
摘要
脓毒症、严重脓毒症和脓毒性休克是非心脏重症监护病房的主要死亡原因。免疫代谢与脓毒症有关；然而，代谢重编程调控炎症反应的确切机制尚不清楚。本研究表明，有氧糖酵解通过调节巨噬细胞中的炎症小体活化促进脓毒症。PKM2介导的糖酵解通过调节巨噬细胞中EIF2AK2磷酸化促进炎症小体活化。药理学和遗传学抑制PKM2或EIF2AK2可减弱NLRP3和AIM2炎症小体活化，并因此抑制巨噬细胞释放IL-1β、IL-18和HMGB1。药理学抑制PKM2–EIF2AK2通路可保护小鼠免受致死性内毒素血症和多微生物脓毒症。此外，髓系细胞中PKM2的条件性敲除可保护小鼠免受NLRP3和AIM2炎症小体活化诱导的脓毒症死亡。这些发现确定了PKM2在免疫代谢中的重要作用，并指导未来治疗脓毒症的策略开发。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PKM2依赖的糖酵解是否以及如何通过调节巨噬细胞炎症小体活化来促进脓毒症中的炎症反应。
- 核心机制
- PKM2介导的糖酵解及乳酸产生促进巨噬细胞中EIF2AK2磷酸化，进而选择性激活NLRP3和AIM2炎症小体，导致IL-1β、IL-18和HMGB1释放。
- 主要证据
- 在LPS预处理的BMDMs、PMs和PMA分化的THP1细胞中，shikonin或PKM2 shRNA抑制NLRP3/AIM2（而非NLRP1/NLRC4）炎症小体活化及IL-1β、IL-18、HMGB1释放；乳酸可诱导EIF2AK2磷酸化，C16或EIF2AK2 shRNA抑制该效应；体内shikonin或C16保护小鼠免受致死性内毒素血症和CLP脓毒症，髓系PKM2敲除小鼠同样获得保护。
- 研究意义
- 研究定义了PKM2在免疫代谢中的重要作用，为未来开发治疗脓毒症的策略提供了依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
遗传学抑制PKM2对炎症小体活化的影响
通过shRNA敲低PKM2确认其对NLRP3和AIM2炎症小体活化的作用。
用PKM2特异性shRNA慢病毒转导BMDMs、PMA分化的THP1细胞和PMs，LPS预处理后给予炎症小体激活剂，检测细胞因子释放、caspase-1活化和PKM2二聚体形成。
PKM2依赖的糖酵解对炎症小体活化的作用
验证糖酵解代谢及糖酵解相关基因是否参与NLRP3和AIM2炎症小体活化。
检测shikonin、2DG或PKM2 shRNA对PEP和乳酸水平的影响；敲低SLC2A1、LDHA或PDK1后检测乳酸产生、IL-1β/HMGB1释放和caspase-1活化；检测线粒体膜电位、MitoSOX和自噬标志物。
PKM2在caspase-1缺陷巨噬细胞中对糖酵解和PYCARD复合物的影响
探讨PKM2是否影响caspase-1缺陷背景下的糖酵解及炎症小体接头蛋白相互作用。
在caspase-1−/− BMDMs中，给予shikonin或PKM2 shRNA，检测PEP/乳酸产生、NLRP3或AIM2与PYCARD的相互作用、LDH释放和线粒体膜电位。
乳酸通过EIF2AK2磷酸化促进炎症小体活化
验证PKM2依赖的乳酸产生是否通过EIF2AK2磷酸化调控炎症小体活化。
检测shikonin、PKM2 shRNA或PDK1 shRNA对ATP/poly(dA:dT)诱导的EIF2AK2磷酸化的影响；用乳酸处理BMDMs，结合C16、EIF2AK2 shRNA、caspase-1/11敲除、NLRP3/AIM2/NLRC4/NLRP1敲除及P2RX7拮抗剂A-438079，检测细胞因子释放和caspase-1/11活化。
药理学抑制PKM2–EIF2AK2通路对脓毒症小鼠的保护作用
评估靶向PKM2–EIF2AK2通路在致死性内毒素血症和多微生物脓毒症模型中的治疗潜力。
在LPS诱导的内毒素血症和CLP诱导的脓毒症小鼠中，给予shikonin或C16，检测腹腔巨噬细胞EIF2AK2磷酸化、caspase-1活性、血清IL-1β和HMGB1水平及生存率。
髓系细胞PKM2敲除对NLRP3和AIM2炎症小体活化诱导死亡的保护作用
通过遗传学模型确认PKM2在体内NLRP3和AIM2炎症小体活化中的作用。
构建髓系细胞特异性PKM2敲除小鼠（PKM2flox/flox × LysM-Cre），LPS预处理后给予ATP或nucleosome，检测生存率和血清IL-1β、HMGB1水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞刺激 | 脂多糖（大肠杆菌LPS 0111:B4） | Sigma | L4391 |
| 糖酵解抑制 | 2-脱氧-D-葡萄糖 | Sigma | D8375 |
| EIF2AK2抑制 | C16 | Sigma | I9785 |
| P2RX7拮抗 | A438079 | Sigma | A9736 |
| 乳酸处理 | 乳酸 | Sigma | L6661 |
| PKM2抑制 | 紫草素 | Millipore Corporation | 517-89-5 |
| 炎症小体激活 | 三磷酸腺苷 | InvivoGen | tlrl-atp |
| poly(dA:dT)/LyoVec | InvivoGen | tlrl-patc | |
| 转染对照 | LyoVec | InvivoGen | lyec-12 |
| 炎症小体激活 | 胞壁酰二肽 | InvivoGen | tlrl-mdp |
| 鞭毛蛋白 | InvivoGen | tlrl-stfla | |
| AIM2炎症小体激活 | 纯化核小体 | EpiCypher | 16-0002 |
| 细胞因子检测 | HMGB1酶联免疫吸附测定试剂盒 | Shino Test Corporation | ST51011 |
| IL-1β酶联免疫吸附测定试剂盒 | R&D | MLB00C | |
| IL-1β酶联免疫吸附测定试剂盒 | R&D | DY201 | |
| IL-18酶联免疫吸附测定试剂盒 | R&D | 7625 | |
| IL-18酶联免疫吸附测定试剂盒 | R&D | 7620 | |
| 代谢物检测 | L-乳酸测定试剂盒 | Abcam | ab65331 |
| caspase活性检测 | caspase-1测定试剂盒 | Abcam | ab39412 |
| caspase-11测定试剂盒 | Abbexa Ltd | abx255239 | |
| 细胞毒性检测 | 乳酸脱氢酶测定试剂盒 | Abcam | ab102526 |
| 线粒体膜电位检测 | TMRE线粒体膜电位测定试剂盒 | Abcam | ab113852 |
| 线粒体ROS检测 | MitoSox | Thermo Fisher Scientific Inc. | M36008 |
| RNA干扰 | 对照空载shRNA | Sigma | SHC001 |
| Western blot | IL-1β抗体 | R&D | AF-401-NA |
| caspase-1抗体 | Adipogen | AG-20B-0042 | |
| NLRP3抗体 | Adipogen | AG-20B-0014 | |
| PKM2抗体 | Cell Signaling Technology | 4053 | |
| PKM1抗体 | Cell Signaling Technology | 7067 | |
| ACTB抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| AIM2抗体 | Cell Signaling Technology | 13095 | |
| PDK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3062 | |
| EIF2AK2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1702 | |
| SQSTM1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28359 | |
| PYCARD抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-22514-R | |
| 磷酸化EIF2AK2抗体 | Millipore | 07-886 | |
| MAP1LC3B抗体 | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| 增强化学发光 | Pierce | 32106 | |
| 免疫沉淀 | Protein A/G琼脂糖/琼脂糖珠 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 20423 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 巨噬细胞炎症小体活化检测 | LPS预处理浓度与时间（500 ng/ml，3 h）、ATP（5 mM，30 min）、poly(dA:dT)（1 μg/ml，8 h）、MDP（200 ng/ml，8 h）、flagellin（200 ng/ml，8 h）的刺激条件及检测终点（ELISA、caspase-1活性、Western blot） 阅读提示：Methods的Cell culture小节及Figure 1、2图注 |
| PKM2药理学和遗传学抑制 | shikonin浓度（1和5 μM）、PKM2 shRNA转导时间（48 h）及对照shRNA设置 阅读提示：Methods的Reagents、RNAi小节及Figure 1、2图注 |
| 乳酸和EIF2AK2通路验证 | 乳酸浓度（5 mM，3 h）、C16浓度（1和5 μM）、EIF2AK2 shRNA及caspase-1/11、NLRP3、AIM2等基因敲除小鼠来源细胞的基因型 阅读提示：Methods的Cell culture、RNAi小节及Figure 5图注 |
| 体内内毒素血症和CLP脓毒症模型 | LPS剂量（5 mg/kg，i.p.）、CLP手术、shikonin（8 mg/kg）和C16（内毒素血症8 mg/kg；CLP 50 μg/kg）的给药时间点、每组动物数（n=20）及生存观察期 阅读提示：Methods的Animal model of endotoxemia and sepsis小节及Figure 6图注 |
| 髓系PKM2敲除小鼠模型 | PKM2flox/flox与LysM-Cre杂交策略、LPS（2 mg/kg）预处理3 h后ATP（200 mg/kg）或nucleosome（20 mg/kg）攻击、每组动物数（n=10） 阅读提示：Methods的Animal model of endotoxemia and sepsis小节及Figure 7图注 |