DAPK缺陷对T细胞活化和EAE的影响
验证DAPK是否负调控T细胞活化和自身免疫性脑脊髓炎。
比较Dapk−/−与WT小鼠T细胞增殖、细胞因子产生及MOG35–55诱导EAE的发病和病理；并检测[ΔCAM]DAPK转基因小鼠的EAE。
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肿瘤抑制因子死亡相关蛋白激酶靶向胞质HIF-1α以抑制Th17
Tumour suppressor death-associated protein kinase targets cytoplasmic HIF-1α for Th17 suppression.
实验完整度
高包含体外T细胞分化、HEK293T/Jurkat细胞系、多种基因敲除/转基因小鼠模型及EAE体内功能验证。
主要模型
Dapk−/−与[ΔCAM]DAPK转基因小鼠的原代CD4+ T细胞 HEK293T、HeLa和Jurkat T细胞系 MOG35–55诱导的EAE小鼠模型 2D2 TCR转基因T细胞过继转移Rag1−/−小鼠模型
重点核对
Dapk−/−小鼠与WT同窝对照在MOG35–55/CFA免疫及百日咳毒素处理后的EAE临床评分（n=10/组） Th17分化条件：TGF-β 2 ng/ml、IL-6 2 ng/ml及抗IL-2/抗IL-4/抗IFN-γ各5 μg/ml DAPK与HIF-1α的共免疫沉淀及细胞质/细胞核组分分离定位 MG132（5 μM或10 μM）处理验证蛋白酶体依赖性HIF-1α降解 PHD2敲低（siPHD2）或DFX（10 μM）处理验证PHD2依赖性
摘要
死亡相关蛋白激酶（DAPK）是一种肿瘤抑制因子。在此我们显示，DAPK也抑制辅助性T细胞17（Th17），并在自身免疫小鼠模型中阻止Th17介导的病理。我们证明DAPK特异性下调缺氧诱导因子1α（HIF-1α）。与HIF-1α在许多细胞类型中主要定位于核内不同，HIF-1α在T细胞中同时定位于细胞质和细胞核，从而使胞质中的DAPK与HIF-1α相互作用成为可能。DAPK还结合脯氨酰羟化酶结构域蛋白2（PHD2），并增加HIF-1α与PHD2的关联。DAPK由此促进HIF-1α的脯氨酸羟化和蛋白酶体降解。因此，DAPK缺陷导致HIF-1α过度积累、IL-17表达增强和实验性自身免疫性脑脊髓炎加剧。额外敲除HIF-1α可恢复Dapk−/− Th17细胞的正常分化并阻止实验性自身免疫性脑脊髓炎的发生。我们的结果揭示了一种涉及DAPK介导的胞质HIF-1α降解的机制，并提示提高DAPK水平可用于治疗Th17相关炎症性疾病。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DAPK作为肿瘤抑制因子是否以及如何调控Th17分化和Th17介导的自身免疫病理。
- 核心机制
- DAPK与T细胞胞质中的HIF-1α直接结合，并同时结合PHD2，促进HIF-1α的脯氨酸羟化及蛋白酶体降解，从而下调HIF-1α蛋白并抑制Th17分化。
- 主要证据
- Dapk−/− T细胞中HIF-1α蛋白升高而mRNA不变、HIF-1α蛋白稳定性增加；DAPK与HIF-1α/PHD2共沉淀及共定位；PHD2敲低或DFX处理阻断DAPK诱导的HIF-1α降解；Dapk−/−Hif1a−/−双敲除恢复Th17分化和减轻EAE。
- 研究意义
- 揭示DAPK介导胞质HIF-1α降解的机制，提示提高DAPK水平可能用于治疗Th17相关炎症性疾病。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
DAPK对Th17分化的调控
验证DAPK是否抑制Th17分化及Th17相关基因表达。
在TGF-β和IL-6条件下诱导naive CD4+ T细胞向Th17分化，检测IL-17产生、Th17相关基因表达及RORγt/RORα蛋白水平。
DAPK对HIF-1α蛋白稳定性的调控
验证DAPK是否在转录后水平下调HIF-1α蛋白。
检测Dapk−/− Th17细胞中HIF-1α蛋白和mRNA水平；用CHX chase和MG132处理分析HIF-1α蛋白稳定性及蛋白酶体依赖性。
DAPK与HIF-1α的相互作用及亚细胞定位
验证DAPK是否在T细胞胞质中与HIF-1α直接结合。
用核质分离、共聚焦显微镜和共免疫沉淀检测HIF-1α在T细胞中的胞质定位及其与DAPK的结合。
DAPK通过PHD2促进HIF-1α羟化和降解
验证DAPK是否通过PHD2介导的脯氨酸羟化促进HIF-1α降解。
检测HIF-1α Pro564羟化水平、PHD2敲低或DFX处理对DAPK诱导HIF-1α降解的影响，以及DAPK与PHD2的相互作用。
HIF-1α敲除对Dapk−/− Th17分化和EAE的挽救
验证HIF-1α是否介导Dapk−/− T细胞中增强的Th17分化和EAE。
构建Dapk−/−Hif1a−/−双敲除小鼠，检测Th17分化、RORγt水平和EAE临床评分。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| T细胞刺激 | 钙离子载体A23187 | Sigma | -- |
| 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | Sigma | -- | |
| 蛋白酶体抑制 | MG132 | Sigma | -- |
| 溶酶体抑制 | 氯喹 | Sigma | -- |
| 氯化铵 | Sigma | -- | |
| 亮抑酶肽 | Sigma | -- | |
| PHD抑制 | 去铁胺甲磺酸盐 | Sigma | -- |
| Western blot | 抗DAPK抗体 | Sigma | D2178 |
| 抗HA抗体 | Sigma | H3633 | |
| 抗FLAG抗体 | Sigma | F1804 | |
| 抗RORγt抗体 | eBioscience | 14–6981 | |
| 流式细胞术 | 抗CD4-PE-Cy7抗体 | eBioscience | 25-0041 |
| 抗CD62L-APC抗体 | eBioscience | 17–0621 | |
| Th17分化 | 重组小鼠IL-6 | eBioscience | 14–8061 |
| 重组小鼠IL-23 | eBioscience | 14–8231 | |
| Western blot | 抗磷酸化STAT3Y705抗体 | Cell Signaling Technology | 9131 |
| 抗PHD2抗体 | Cell Signaling Technology | 4835 | |
| 抗羟化HIF-1αP564抗体 | Cell Signaling Technology | 3434 | |
| 抗小鼠HIF-1α抗体 | Cayman Chemicals | 10006421 | |
| 抗人HIF-1α抗体 | BD-Biosciences | 610959 | |
| 流式细胞术 | 抗IL-17A-PE抗体 | BioLegend | 506904 |
| 免疫荧光 | 抗IL-17抗体 | Abcam | ab91649 |
| 抗IFN-γ抗体 | BioLegend | 507801 | |
| Th1分化 | 重组小鼠IL-12 | R&D | -- |
| Th17分化 | 重组小鼠IL-21 | R&D | -- |
| Treg分化 | 人TGF-β | PeproTech | -- |
| 共免疫沉淀 | 抗HIF-1α抗体 | Bethyl Laboratories | A300-286A |
| 免疫荧光 | Alexa Flour488标记山羊抗小鼠IgG | Thermo Fisher Scientific | A11001 |
| siRNA敲低 | EGLN1 siRNA SMARTpool | GE Dharmacon | -- |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Invitrogen Life Technology | -- |
| 胎牛血清 | Invitrogen Life Technology | -- | |
| 低氧培养 | 氧气控制器ProOx-110 | BioSpherix | ProOx-110 |
| 电转染 | MP-100电转系统 | Life Technologies | MP-100 |
| EAE诱导 | MOG肽35–55 | Kelowna | -- |
| 百日咳毒素 | List Labs | -- | |
| Western blot | ECL蛋白质印迹检测试剂盒 | GE Healthcare | -- |
| 免疫荧光 | DAPI Fluoromount-G封片剂 | SouthernBiotech | -- |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss LSM 780共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM 780 |
| 组织切片成像 | Zeiss Axio Imager Z1显微镜 | Zeiss | Axio Imager Z1 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EAE诱导 | MOG35–55剂量200 μg/只、CFA中结核分枝杆菌400 μg、百日咳毒素200 ng/只于第0和2天腹腔注射、n=10/组 阅读提示：Methods的EAE induction小节及Figure 1a图注 |
| Th17分化 | TGF-β 2 ng/ml、IL-6 2 ng/ml、抗IL-2/抗IL-4/抗IFN-γ各5 μg/ml、抗CD3 2 μg/ml和抗CD28 1 μg/ml包被、分化3–5天 阅读提示：Methods的Induction of T-helper cells and iTregs小节 |
| HIF-1α蛋白稳定性检测 | CHX浓度（HEK293T 50 ng/ml，T细胞25 ng/ml）、MG132浓度（HEK293T 10 μM，T细胞5 μM）、处理时间 阅读提示：Figure 3e–h图注及Methods相关描述 |
| DAPK与HIF-1α相互作用 | 低氧条件1% O2处理时间（Jurkat 4小时）、共免疫沉淀抗体及转染质粒标签 阅读提示：Figure 4g–i图注及Methods的In vitro binding assays小节 |
| PHD2依赖性验证 | DFX 10 μM处理24小时、siPHD2转染、MG132 5–10 μM处理 阅读提示：Figure 5b–g图注及Methods |