建立Myc依赖的ESC自我更新体系
验证MycER激活能否替代LIF维持ESC自我更新。
比较LIF维持和OHT激活MycER的ESC在集落形成、单细胞克隆、长期传代和细胞周期上的表现。
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Myc驱动的自我强化调控网络维持小鼠胚胎干细胞身份
A Myc-driven self-reinforcing regulatory network maintains mouse embryonic stem cell identity.
实验完整度
高包含体外ESC模型、表观遗传组学、蛋白互作、功能回补和体内嵌合体实验等多层级证据，并明确机制验证。
主要模型
R1小鼠胚胎干细胞（MycER条件表达） EpiSC（上胚层干细胞） Myc衍生胚胎干细胞（-Myc） 嵌合体小鼠及畸胎瘤模型
重点核对
MycER激活由OHT诱导，浓度50 nM，撤药16小时用于表观遗传分析 Myc和Mycn双敲低（dKD或i-dKD）用于验证内源性Myc功能 PRC2功能通过Eed/Ezh2敲低或EPZ005687（1 μM）、GSK126（2 μM）抑制验证 Wnt通路依赖通过β-catenin敲低及Dkk1/sFRP1抑制、Wnt3a回补验证 ChIP-seq和ChIP-qPCR检测H3K4me3、H3K27me3、Suz12、Myc、β-catenin在靶基因的富集
摘要
干细胞身份取决于外源和内源信号的整合，这些信号直接影响其表观遗传状态的维持。尽管Myc转录因子在干细胞自我更新和多能性中发挥主要作用，但它们与信号通路和表观遗传调控因子的整合仍不清楚。我们通过在生长依赖于条件性Myc活性的胚胎干细胞中分析基因表达和表观遗传模式来解决这个问题。在这里我们显示，Myc增强Wnt/β-catenin信号通路，该通路与转录调控网络协同维持胚胎干细胞自我更新。Myc激活通过直接招募PRC2到Wnt拮抗剂靶点导致其转录抑制。随之而来的自分泌Wnt/β-catenin信号通路的增强诱导内源性Myc家族成员的转录激活，进而激活一个Myc驱动的自我强化回路。因此，我们的数据揭示了在维持胚胎干细胞自我更新能力中一个Myc依赖的自我传播的表观遗传记忆。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Myc如何整合信号通路和表观遗传调控因子以维持胚胎干细胞身份？
- 核心机制
- Myc直接招募PRC2至Wnt拮抗剂基因，增加H3K27me3并抑制其转录，从而增强自分泌Wnt/β-catenin信号；Wnt信号激活内源性Myc和Mycn，形成自我强化正反馈回路。
- 主要证据
- MycER激活可替代LIF维持ESC自我更新；ChIP-seq显示Myc激活后Wnt拮抗剂获得H3K27me3和Suz12；PRC2敲低或抑制破坏Myc-ESC自我更新，Wnt3a可回补；Myc衍生ESC在撤除OHT和LIF后长期自我更新并形成嵌合体。
- 研究意义
- 揭示Myc通过PRC2介导的表观遗传记忆建立自我强化调控网络，为理解干细胞身份维持的表观遗传机制提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析Myc依赖ESC的转录程序
确定Myc激活是否建立替代LIF的转录调控网络。
对LIF、Myc和EpiSC进行基因表达谱分析，包括PCA、IPA、GSEA和PluriTest。
验证Myc对Wnt/β-catenin通路的增强作用
检验Myc是否通过Wnt信号维持ESC自我更新。
Western blot检测Wnt通路蛋白，PLA检测β-catenin与Tcf1/Tcf3邻近，β-catenin敲低及Dkk1/sFRP1抑制后评估自我更新。
解析Myc对二价基因表观遗传状态的调控
明确Myc是否改变Wnt相关二价基因的染色质状态。
ChIP-seq检测H3K4me3、H3K27me3和Suz12在LIF与Myc-ESC中的分布，并关联基因表达变化。
验证Myc与PRC2的直接相互作用及招募机制
确定Myc是否直接结合PRC2并招募其至Wnt拮抗剂基因。
PLA、Co-IP、GST pull-down、apFRET和体外重构PRC2实验检测Myc-PRC2互作；ChIP检测Myc调控下PRC2和H3K27me3在Wnt拮抗剂启动子的水平。
验证Myc-Wnt正反馈回路及内源性Myc的作用
检验Wnt信号是否激活内源性Myc/Mycn并维持自我更新。
Dkk1/sFRP1处理后的基因表达谱和ChIP检测β-catenin在Myc/Mycn WRE的结合；诱导性Myc/Mycn双敲低（i-dKD）后评估自我更新及Wnt3a响应。
建立并表征Myc衍生ESC的表观遗传记忆
验证撤除MycER激活和LIF后，自我强化回路能否维持ESC身份。
撤除OHT和LIF长期培养Myc衍生ESC，检测自我更新、多能性、嵌合体形成和PRC2依赖性；并通过LIF再培养逆转回LIF依赖状态。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Hyclone Millipore | ES-009-B |
| MEM非必需氨基酸 | Invitrogen | 1140-036 | |
| 维生素C（L-抗坏血酸-2-磷酸酶） | Sigma | A8960 | |
| 白血病抑制因子 | Millipore | ESG1107 | |
| 4-羟基他莫昔芬 | Sigma | H6278 | |
| CHIR99021 | AbCam | ab120890 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Invitrogen | 13256029 | |
| 激活素A | R&D | 338-AC | |
| IV型胶原酶 | Gibco | 17104-019 | |
| 药物处理 | Dkk1 | R&D | 5897-DK |
| Sfrp1 | R&D | 1384-SF | |
| Wnt-3a | R&D | 5036-WN | |
| EPZ005687 | BioVision | 2364 | |
| GSK126 | BioVision | 2282 | |
| AG490 | Invivogen | tlrl-ag4 | |
| Jak1 | Millipore | 420099 | |
| XAV939 | AbCam | ab120897 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Ambion | 15596-026 |
| RT-qPCR | Superscript III Platinum一步法qRT-PCR试剂盒 | Invitrogen | 11732-088 |
| SYTO9绿色荧光DNA染料 | Invitrogen | S-34854 | |
| Rotor-Gene Q热循环仪 | Qiagen | 9001560 | |
| ERCC外源对照RNA | Ambion | 4456740 | |
| 微阵列 | Illumina TotalPrep RNA扩增试剂盒 | Ambion | AMIL1791 |
| Agilent生物分析仪 | Agilent Technologies | G2943CA | |
| MouseRef-8 v2 BeadChip芯片 | Illumina | 1128893 | |
| Western blot | Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Scientific | 23227 |
| Bolt 4–12% Bis-Tris Plus凝胶 | Novex | NW04122BOX | |
| Bolt MES运行缓冲液 | Novex | B0002 | |
| 印迹级封闭剂 | Bio-Rad | 170-6404 | |
| ECL试剂 | GE Healthcare | RPN2232 | |
| LAS3000成像系统 | GE Healthcare | -- | |
| ChIP | 蛋白G偶联Dynabeads | -- | -- |
| SYBR GreenER试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| 二-N-琥珀酰亚胺戊二酸酯 | Sigma | 80424 | |
| ChIP-seq | NEB快速连接试剂盒 | -- | M2200L |
| PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶试剂盒 | Agilent | 600674 | |
| Agencourt AMPure XP SPRI磁珠 | Beckman | A63882 | |
| Illumina HiSeq2000测序仪 | Illumina | -- | |
| 流式细胞术 | 抗Oct4抗体 | Santa Cruz | sc-5279 |
| 抗Nanog抗体 | Bethyl | A300-397A | |
| 抗小鼠IgG-Alexa Fluor-647 | Invitrogen | A21236 | |
| 抗兔IgG-Alexa Fluor-405 | Invitrogen | A31556 | |
| DNA con 3试剂盒 | Consul T.S. | -- | |
| 免疫荧光 | 抗MYC抗体 | Santa Cruz | sc-764 |
| 抗Eed抗体 | Millipore | 05-1320 | |
| 抗Ezh2抗体 | Cell Signalling | AC22 | |
| 抗Suz12抗体 | Cell Signalling | D39F6 | |
| 抗Aebp2抗体 | Abcam | ab101655 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Myc依赖ESC维持 | OHT浓度（50 nM）、LIF浓度（100 U/ml）、传代时间（3天或长期至18天）、AP染色阳性集落计数标准 阅读提示：Methods 'Cell culture conditions'及Figure 1 legend |
| Myc/Mycn敲低 | shRNA序列货号（TRCN0000042515, TRCN0000020694）、诱导条件（IPTG或OHT撤药）、敲低效率验证 阅读提示：Methods 'DNA constructs'及Supplementary Fig. 4g, 7a,b |
| PRC2抑制或敲低 | EPZ005687浓度（1 μM）、GSK126浓度（2 μM）、Eed/Ezh2 shRNA货号（TRCN0000095722, TRCN0000039042）、处理时间 阅读提示：Methods 'Reagents'及Figure 3g, 6f legend |
| Wnt通路干预 | Dkk1（100 ng/ml）、Sfrp1（100 ng/ml）、Wnt3a（100 ng/ml）处理浓度和时间；β-catenin shRNA货号（TRCN0000012690） 阅读提示：Methods 'Reagents'及Figure 2e, 5e,f legend |
| ChIP-seq和ChIP-qPCR | 抗体用量（4 μg）、染色质片段大小（0.1–0.5 kb）、交联条件（1%甲醛10分钟）、β-catenin ChIP额外交联（2 mM Di-N-succinimidylglutarate） 阅读提示：Methods 'ChIP assay'及'ChIP-seq library generation and data analysis' |