三阶段GWAS发现易感位点
在中国汉族人群中识别与结直肠癌风险相关的新遗传变异。
第一阶段对1,023例病例和1,306例对照进行全基因组基因分型；第二阶段在Nanjing-2的855例病例和1,258例对照中复制53个SNP；第三阶段在六个独立中心（4,462例病例和5,629例对照）中复制rs2238126，并进行荟萃分析。
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ETV6常见遗传变异与结直肠癌易感性相关
Common genetic variation in ETV6 is associated with colorectal cancer susceptibility.
实验完整度
高包含三阶段GWAS、欧洲人群重复、报告基因、EMSA、ChIP、eQTL及细胞功能验证
主要模型
中国汉族结直肠癌病例-对照人群 欧洲血统结直肠癌病例-对照人群 结直肠癌细胞系HCT116、SW480、SW620、HT29和LoVo 结直肠癌组织及配对癌旁正常组织
重点核对
rs2238126在八个中国研究中心的基因型分布及荟萃分析结果（P=2.67×10−10，OR=1.17） rs2238126在欧洲人群中的重复关联（1,046例病例和1,076例对照，P=0.034） 荧光素酶报告基因实验中rs2238126 A/G等位基因对增强子活性的影响（HCT116和SW480细胞，转染后24小时检测） EMSA中rs2238126 A/G探针与HCT116核提取物的结合差异及300倍未标记探针竞争 ChIP实验中HCT116细胞MAX抗体（ab53570）富集含rs2238126区域
摘要
全基因组关联研究（GWAS）已发现多个结直肠癌易感位点，但大部分遗传力仍未得到解释。为识别更多结直肠癌易感位点，我们在1,023例病例和1,306例对照中进行了GWAS，并在来自中国的七个独立样本（包括5,317例病例和6,887例对照）中重复了这些发现。我们发现12p13.2的一个变异与结直肠癌风险相关（ETV6中的rs2238126，P=2.67×10−10）。我们在另外1,046例欧洲血统病例和1,076例对照中重复了这种关联（P=0.034）。rs2238126的G等位基因使结直肠癌发病年龄更早（P=1.98×10−6），并降低转录增强子MAX的结合亲和力。结直肠肿瘤中ETV6的mRNA水平显著低于配对的正常组织。我们的发现突出了ETV6遗传变异在赋予结直肠癌易感性中的潜在重要性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在中国人群中寻找新的结直肠癌易感位点，并探讨其功能机制。
- 核心机制
- rs2238126位于ETV6内含子，G等位基因降低转录增强子MAX的结合亲和力，可能下调ETV6表达，从而与结直肠癌风险增加相关。
- 主要证据
- 三阶段GWAS及欧洲人群重复发现rs2238126与结直肠癌风险相关；荧光素酶报告基因、EMSA和ChIP实验显示A等位基因比G等位基因增强子活性和MAX结合更高；eQTL分析显示rs2238126与肿瘤组织ETV6表达相关；ETV6过表达抑制结直肠癌细胞增殖。
- 研究意义
- 研究结果提示ETV6遗传变异在结直肠癌易感性中的潜在重要性，并表明遗传标志物可能用于结直肠癌风险预测。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
欧洲人群重复关联
验证rs2238126与结直肠癌风险的关联是否存在于欧洲血统人群。
在来自Ontario Familial Colorectal Cancer Registry的1,046例病例和1,076例对照中检测rs2238126，并与亚洲人群进行荟萃分析。
rs2238126的调控功能验证
验证rs2238126所在区域是否为增强子，以及不同等位基因对MAX结合和增强子活性的影响。
构建含rs2238126 A或G等位基因的增强子-荧光素酶报告载体，转染HCT116和SW480细胞检测荧光素酶活性；EMSA检测A/G探针与HCT116核提取物的结合；ChIP验证MAX结合。
eQTL分析
评估rs2238126与邻近基因mRNA表达的相关性。
利用TCGA中434例结肠腺癌组织和41例正常结肠组织的RNA-Seq数据，分析rs2238126与ETV6及BCL2L14表达的关系。
ETV6表达与功能分析
检测ETV6在结直肠癌中的表达变化及其对细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。
在结直肠癌细胞系中检测ETV6 mRNA和蛋白表达；在112对肿瘤与癌旁正常组织中检测mRNA表达；在67对样本中进行免疫组化；构建ETV6过表达或shRNA敲低载体转染SW480、HCT116和HT29细胞，检测增殖、细胞周期和凋亡。
多易感位点累积效应分析
评估多个结直肠癌风险等位基因的累积效应。
分析风险等位基因在病例和对照中的分布，并计算携带不同数量风险等位基因个体的结直肠癌风险。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA提取 | Qiagen血液DNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| GWAS基因分型 | Illumina Human Omni ZhongHua Bead芯片 | Illumina | -- |
| 复制阶段基因分型 | Sequenom iPLEX MassARRAY检测 | Sequenom | -- |
| TaqMan检测 | -- | -- | |
| 实时定量PCR | ABI 7900HT实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
| 荧光素酶报告基因实验 | pGL3-basic载体 | Promega | -- |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| EMSA | LightShift化学发光EMSA试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| ChIP | ChIP检测试剂盒 | Upstate Biotechnology | -- |
| 抗MAX抗体 | Abcam | ab53570 | |
| 抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| Western blot | 抗ETV6抗体 | Abcam | ab151698 |
| 抗β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 13E5 | |
| 抗兔HRP二抗 | Bioworld Technology | BS13278 | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8细胞增殖检测试剂盒 | Dojindo | -- |
| Infinite M200分光光度计 | Tecan | -- | |
| 细胞周期检测 | FACS Calibur流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 载体构建 | GV358慢病毒载体 | GeneChem | -- |
| GV248慢病毒载体 | GeneChem | -- | |
| GV230载体 | GeneChem | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| GWAS及复制阶段 | 各阶段样本量、人群来源、基因分型平台及质量控制标准 阅读提示：Methods中Study subjects、SNP genotyping and data quality controls in the GWAS stage、SNP selection and genotyping in the replication stages，以及Table 1 |
| rs2238126调控功能验证 | 报告基因实验的细胞系、转染条件、检测时间；EMSA探针序列及竞争实验条件；ChIP抗体及细胞系 阅读提示：Methods中Luciferase activity、Electrophoretic mobility shift assay、ChIP assay，以及Figure 3图注 |
| ETV6表达与功能分析 | 细胞系来源及鉴定、组织样本数量及配对信息、过表达/敲低载体构建及转染筛选条件、功能检测方法 阅读提示：Methods中Quantitative RT–PCR and eQTL analysis、Western blot and immunocytochemistry、Construction and transfection of overexpression and knockdown of ETV6、Cell proliferation and cell death assays，以及Supplementary Table 11 |
| 累积效应分析 | 风险等位基因数量分组、趋势检验方法 阅读提示：Results中Cumulative effects of colorectal cancer susceptibility loci，以及Supplementary Table 8 |