建立谷氨酰胺非依赖和CB-839耐药细胞模型
获得对谷氨酰胺剥夺或GLS抑制具有抗性的癌细胞系
LPS2细胞在无谷氨酰胺的m-DMEM中培养，SUM159PT细胞在含1 μM CB-839的m-DMEM中培养，每48小时更换培养基，约6周后观察到重新增殖。
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天冬酰胺作为氨基酸交换因子促进癌细胞增殖
Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor.
实验完整度
中使用多种癌细胞系、代谢物LC-MS、免疫印迹、同位素标记等，但缺乏动物模型验证。
主要模型
LPS2亲本及谷氨酰胺非依赖细胞 SUM159PT亲本及CB-839耐药细胞 HeLa细胞 A431细胞
重点核对
LPS2和SUM159PT细胞在0.1 mM天冬酰胺存在或缺乏下的增殖曲线 U-13C-天冬酰胺标记24小时后细胞内13C-天冬酰胺百分比 ASNS敲低后HeLa细胞在添加或不添加0.1 mM天冬酰胺时的相对生长率 天冬酰胺预载后氨基酸刺激下培养基和细胞内谷氨酰胺/天冬酰胺水平 ASNS敲低后HeLa细胞mTORC1活性（pS6K T389、pS6 S235/236）和4E-BP1磷酸化状态
摘要
细胞氨基酸摄取对mTOR复合物1（mTORC1）激活和细胞增殖至关重要。然而，氨基酸摄取的调控机制尚不清楚。本文中我们描述了天冬酰胺作为氨基酸交换因子的作用：细胞内天冬酰胺与细胞外氨基酸交换。通过天冬酰胺合成酶敲低和改变培养基天冬酰胺浓度，我们发现细胞内天冬酰胺水平调控氨基酸的摄取，尤其是丝氨酸、精氨酸和组氨酸。通过其交换因子作用，天冬酰胺调控mTORC1活性和蛋白质合成。此外，我们发现天冬酰胺对丝氨酸摄取的调控影响丝氨酸代谢和核苷酸合成，提示天冬酰胺参与协调蛋白质和核苷酸合成。最后，我们发现维持细胞内天冬酰胺水平对癌细胞生长至关重要。总之，我们的结果表明天冬酰胺是癌细胞氨基酸稳态、合成代谢和增殖的重要调控因子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 天冬酰胺是否作为氨基酸交换因子调控氨基酸摄取、mTORC1活性、蛋白质和核苷酸合成以及癌细胞增殖？
- 核心机制
- 细胞内天冬酰胺与细胞外氨基酸（尤其是丝氨酸、精氨酸和组氨酸）交换，通过该交换因子作用调控mTORC1活性和蛋白质合成，并影响丝氨酸代谢和核苷酸合成。
- 主要证据
- 在LPS2、SUM159PT、HeLa等细胞中，通过ASNS敲低、天冬酰胺预载和培养基天冬酰胺浓度改变，结合LC-MS代谢物分析、免疫印迹和同位素标记，证明天冬酰胺交换调控氨基酸摄取、mTORC1、蛋白质和核苷酸合成及细胞增殖。
- 研究意义
- 天冬酰胺是癌细胞氨基酸稳态、合成代谢和增殖的重要调控因子，提示靶向天冬酰胺或谷氨酰胺代谢联合特殊饮食可能改善天冬酰胺酶和GLS抑制剂的疗效。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测谷氨酰胺非依赖细胞的增殖依赖
验证抗性细胞是否依赖外源性天冬酰胺增殖
在含或不含0.1 mM天冬酰胺的培养基中培养亲本和抗性细胞，每24小时计数，持续72或96小时。
检测天冬酰胺是否被代谢
确定抗性细胞是否分解代谢天冬酰胺
用U-13C-天冬酰胺或U-15N-天冬酰胺标记培养基24小时，LC-MS检测代谢物标记。
验证天冬酰胺作为交换因子
检验细胞内天冬酰胺能否与细胞外氨基酸交换
血清和氨基酸饥饿的LPS2细胞预载2 mM谷氨酰胺、2 mM天冬酰胺或两者组合60分钟，洗涤后加入无谷氨酰胺/天冬酰胺的氨基酸混合物30分钟，LC-MS检测培养基和细胞内谷氨酰胺/天冬酰胺水平。
检测ASNS敲低对氨基酸摄取的影响
确定细胞内天冬酰胺水平是否调控正常生长条件下的氨基酸摄取
在HeLa细胞中稳定表达ASNS shRNA或对照shRNA，在DMEM（含4 mM谷氨酰胺，不含天冬酰胺）中培养，24小时孵育后LC-MS检测细胞外氨基酸水平变化，并测试添加0.1 mM天冬酰胺的挽救效果。
检测天冬酰胺对丝氨酸摄取和代谢的调控
探究天冬酰胺是否偏好与特定氨基酸交换并影响丝氨酸代谢
天冬酰胺预载的LPS2细胞用非极性、碱性或丝氨酸/苏氨酸氨基酸亚类刺激，LC-MS检测天冬酰胺输出和细胞内氨基酸水平；ASNS敲低HeLa细胞中检测丝氨酸合成途径酶表达、ATF4结合和mRNA水平。
检测天冬酰胺对mTORC1活性的调控
验证天冬酰胺水平是否影响mTORC1激活
在LPS2、HeLa、A431细胞中，通过预载天冬酰胺/谷氨酰胺、饥饿天冬酰胺/谷氨酰胺、ASNS敲低和天冬酰胺补充，免疫印迹检测mTORC1下游标志物（pS6K T389、pS6 S235/236）和自噬标志物LC3-II。
检测天冬酰胺对蛋白质合成和核苷酸合成的影响
确定天冬酰胺是否协调蛋白质和核苷酸合成
ASNS敲低HeLa细胞中，检测4E-BP1磷酸化、4E-BP1-eIF4E结合、35S-甲硫氨酸掺入率、CAD磷酸化、PRPS1/2蛋白水平、PRPP水平、15N-丝氨酸掺入嘌呤和嘧啶水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Invitrogen | A14430-01 |
| 透析胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| 药物处理 | CB-839 | Calithera Biosciences | -- |
| 代谢物分析 | Q Exactive质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| UltiMate 3000RSLC超高效液相色谱系统 | Thermo Scientific | -- | |
| Luna 3 mm NH2 100 A色谱柱（150 × 2.0 mm） | Phenomenex | -- | |
| TraceFinder 3.1软件 | Thermo Scientific | -- | |
| 谷氨酰胺消耗分析 | BioProfile Basic分析仪 | Nova Biomedical | -- |
| 免疫印迹 | ASNS抗体（14681-1-AP） | Proteintech | 14681-1-AP |
| 磷酸化T389 S6激酶抗体（9234） | Cell Signaling | 9234 | |
| S6激酶抗体（2708） | Cell Signaling | 2708 | |
| 磷酸化S235/235 S6核糖体蛋白抗体（4858） | Cell Signaling | 4858 | |
| S6核糖体蛋白抗体（2217） | Cell Signaling | 2217 | |
| LC3A/B抗体（4108） | Cell Signaling | 4108 | |
| PHGDH抗体（13428） | Cell Signaling | 13428 | |
| PSAT1抗体（H00029968-A01） | Abnova | H00029968-A01 | |
| PSPH抗体（HPA020376） | Sigma | HPA020376 | |
| SHMT1抗体（ab55736） | Abcam | ab55736 | |
| SHMT2抗体（12762） | Cell Signaling | 12762 | |
| PRPS2抗体（H00005634-A01） | Abnova | H00005634-A01 | |
| 4E-BP1抗体（9452） | Cell Signaling | 9452 | |
| α-微管蛋白抗体（T6074） | Sigma | T6074 | |
| 染色质免疫沉淀 | 抗ATF4抗体（10835-1-AP） | Proteintech | 10835-1-AP |
| 正常兔IgG | Santa Cruz | -- | |
| 实时定量PCR | RNeasy试剂盒 | Qiagen | -- |
| iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| SYBR Green I Master Mix | Roche | -- | |
| LightCycler 480 | Roche | -- | |
| 翻译率检测 | 35S-甲硫氨酸 | PerkinElmer | -- |
| shRNA敲低 | pLKO.1-puro载体 | Sigma | -- |
| pENTR/H1/TO载体 | Invitrogen | K4920-00 | |
| Gateway LR Clonase II | Invitrogen | 11791-020 | |
| pLentipuro/BLOCK-iT-DEST | Invitrogen | K4925-00 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 增殖实验 | 细胞接种密度5×10^4个/孔；天冬酰胺浓度0.1 mM；培养基类型（DMEM含4 mM谷氨酰胺，不含天冬酰胺）；计数时间点每24小时至72/96小时 阅读提示：Methods中Proliferation assays小节及图1、图2图注 |
| 天冬酰胺交换实验 | 预载浓度2 mM谷氨酰胺/天冬酰胺；预载时间60分钟；氨基酸刺激时间30分钟；AA medium成分；洗涤步骤 阅读提示：Methods中Amino acid starvation and stimulation小节及图3图注 |
| ASNS敲低实验 | shRNA序列；嘌呤霉素浓度2 μg/ml；多西环素诱导浓度25 ng/ml；敲低时间48或72小时 阅读提示：Methods中shRNA-mediated knockdown小节及图2、图5、图7图注 |
| 代谢物LC-MS分析 | 代谢物提取方法；LC-MS参数；内标norvaline用量10 nmol；色谱柱类型；数据分析软件 阅读提示：Methods中Intracellular metabolite extraction and analysis小节 |
| mTORC1活性检测 | 饥饿时间（0、5、15分钟至24小时）；抗体稀释比例；天冬酰胺/谷氨酰胺饥饿条件 阅读提示：Methods中Amino acid starvation and stimulation和Cell lysis and immunoblotting小节及图5图注 |