建立dox诱导GEF表达细胞系统并验证Rac1特异性激活
实现Tiam1和P-Rex1的选择性激活并确认其通过Rac1而非Cdc42/RhoA发挥作用
在NIH3T3细胞中利用dox诱导系统过表达Tiam1 WT、P-Rex1 WT及其GEF*突变体，通过PAK-CRIB pulldown和Rhotekin pulldown检测活性Rac1/Cdc42和RhoA水平，Western blot验证表达和激活特异性。
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鸟嘌呤核苷酸交换因子对Rac1的差异性信号传导表明FLII参与调控Rac1驱动的细胞迁移
Differential Rac1 signalling by guanine nucleotide exchange factors implicates FLII in regulating Rac1-driven cell migration.
实验完整度
高多细胞系体外模型、定量蛋白质组学、多种互作验证及功能回补实验
主要模型
NIH3T3小鼠成纤维细胞系 A431人鳞状细胞癌细胞系 MDCKII犬肾上皮细胞系 原代人成纤维细胞
重点核对
dox诱导GEF表达：1 μg/ml，24-48小时，以乙醇为对照 GEF活性依赖性：使用GEF*突变体排除过表达非特异效应 FLII敲低：两种siRNA，反向转染两次，48小时后再次转染24小时 P-Rex1-Rac1-FLII互作：SILAC、PLA、免疫共沉淀和GST pulldown多方法验证 收缩抑制剂处理：blebbistatin 100 μM或Y27632 10 μM处理24小时
摘要
小GTP酶Rac1与肿瘤的形成和播散有关。在被鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）激活后，Rac1与细胞中多种蛋白质结合，从而调控包括细胞迁移在内的多种功能。然而，Rac1的激活可导致相反的迁移表型，这提出了在临床环境中靶向Rac1时可能加剧肿瘤进展的可能性。这要求鉴定影响Rac1驱动细胞运动的因子。本研究表明，Tiam1和P-Rex1这两种Rac GEFs分别通过调控Rac1相互作用组促进Rac1的抗迁移和促迁移信号级联。特别地，我们证明P-Rex1通过增强Rac1与肌动蛋白重塑蛋白flightless-1同源物之间的相互作用来刺激迁移，以不依赖RhoA-ROCK的方式调节细胞收缩。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 不同的Rac1 GEFs（Tiam1和P-Rex1）是否以及如何通过调控Rac1相互作用组来决定Rac1下游的抗迁移与促迁移表型？
- 核心机制
- Tiam1和P-Rex1通过差异性调控Rac1相互作用组，分别促进Rac1抗迁移和促迁移信号；P-Rex1通过其GEL结构域结合FLII，促进FLII与活性Rac1的LRR结构域结合，以不依赖RhoA-ROCK的方式增强MLC磷酸化和细胞收缩，从而驱动细胞迁移。
- 主要证据
- 在NIH3T3、A431和MDCKII细胞中，dox诱导的Tiam1 WT和P-Rex1 WT（而非GEF*突变体）产生相反的形态、肌动蛋白重塑、细胞散射和迁移表型；SILAC筛选发现P-Rex1 WT特异性增强Rac1与FLII结合；PLA、免疫共沉淀和GST pulldown验证Rac1-FLII及P-Rex1-FLII互作；FLII敲低消除P-Rex1 WT促迁移作用并降低pMLC水平；blebbistatin（而非ROCK抑制剂）抑制P-Rex1驱动的迁移。
- 研究意义
- 本研究揭示了GEFs通过调控效应器结合来决定Rac1功能特异性的重要性，并发现了一条此前未报道的P-Rex1-Rac1-FLII信号级联调控细胞迁移，为理解P-Rex1和Rac1驱动癌症播散的额外模式提供了线索。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估GEF诱导的细胞形态、肌动蛋白重塑和迁移表型
验证Tiam1和P-Rex1是否诱导相反的Rac1驱动迁移表型
在NIH3T3、A431和MDCKII细胞中，dox诱导GEF表达后通过相差显微镜观察形态、phalloidin染色观察肌动蛋白、Oris迁移实验和细胞散射实验评估迁移和散射能力。
SILAC定量蛋白质组学筛选GEF依赖的Rac1相互作用组
鉴定Tiam1和P-Rex1差异性调控的Rac1结合蛋白
构建StrepII-FLAG-Rac1与GEF（WT或GEF*）共表达的dox诱导系统，进行SF-TAP纯化结合五重SILAC筛选（包括反向SILAC），质谱鉴定Rac1结合蛋白并计算相对丰度。
验证FLII与Rac1及P-Rex1的相互作用和结构域定位
确认FLII是P-Rex1富集的Rac1结合伙伴并解析互作结构域
通过Streptavidin pulldown、内源性免疫共沉淀、GST pulldown（GDP/GTPγS加载）、Duolink in situ PLA、FLAG免疫共沉淀和体外蛋白互作实验验证FLII-Rac1和FLII-P-Rex1互作，并使用FLII结构域突变体（FL、GEL、LRR）定位结合区域。
功能验证FLII在P-Rex1-Rac1驱动迁移和收缩中的作用
确定FLII对P-Rex1促迁移和细胞收缩的表型贡献
利用siRNA敲低FLII，通过Oris迁移实验、单细胞追踪、Western blot检测pMLC，以及成纤维细胞-胶原基质收缩实验评估迁移和收缩能力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Life Technologies | 61965-026 |
| 无四环素胎牛血清 | Labtech International Ltd | FB-1001T/500 | |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | 15140-122 | |
| 低糖DMEM | Life Technologies | 10567-014 | |
| 细胞系构建 | TransIT-LT1转染试剂 | Mirus | MIR 2305 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | 107689 | |
| G418 | Sigma-Aldrich | A1720 | |
| 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| 杀稻瘟菌素 | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| siRNA转染 | DharmaFECT 1转染试剂 | GE Healthcare | T-2001-01 |
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 137781 | |
| siRNA | Dharmacon非靶向siRNA #1 | GE Healthcare | D-001210-01-20 |
| Dharmacon非靶向siRNA #4 | GE Healthcare | D-001210-04-20 | |
| Hs_P-Rex1_5 FlexiTube siRNA | Qiagen | 1027418-SI03144449 | |
| Hs_P-Rex1_6 FlexiTube siRNA | Qiagen | 1027418-SI03246383 | |
| Oris迁移实验 | Dic16染料 | -- | -- |
| 纤连蛋白 | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| 带塞子的96孔板 | Platypus Technologies | CMA1.101 | |
| 收缩抑制剂处理 | (+)-blebbistatin | Merk Millipore | 203392 |
| (±)-blebbistatin | Merk Millipore | 203390 | |
| Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| 生化分析 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P8340 |
| 磷酸酶抑制剂混合物1 | Sigma-Aldrich | P5726 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物2 | Sigma-Aldrich | P0044 | |
| NuPAGE LDS样品缓冲液4× | Life Technologies | NP0008 | |
| NuPAGE样品还原剂10× | Life Technologies | NP0004 | |
| 组织学分析 | 含Phloxine的伊红Y溶液 | Sigma-Aldrich | HT110332 |
| 天狼星红染色试剂盒 | Polysciences | 24901-250 | |
| 免疫组织化学 | 小鼠抗pMLC (Ser19)抗体 | Cell Signaling | 3675 |
| 免疫荧光 | 牛血清白蛋白 | Roche | 10735078001 |
| 含DAPI的ProLong Gold抗淬灭封片剂 | Invitogen | P36935 | |
| Duolink PLA | 小鼠抗Rac1抗体 | BD Biosciences | 610650 |
| 兔抗FLII抗体 | Sigma-Aldrich | HPA007084 | |
| Duolink原位PLA抗小鼠探针 | Olink Bioscience | 92004-0100 | |
| Duolink原位PLA抗兔探针 | Olink Bioscience | 92002-0100 | |
| Duolink原位检测试剂盒 | Olink Bioscience | 92013-0100, 92014-0100 | |
| 小鼠抗FLII抗体 | Santa Cruz | sc-21716 | |
| 兔抗P-Rex1抗体 | Sigma-Aldrich | HPA001927 | |
| 活性GTPase pulldown | Strep-Tactin superflow树脂 | IBA GmbH | 2-1206-10 |
| 活性RhoA pulldown检测试剂盒 | Thermo Scientific | 16116 | |
| 活性RhoG ELISA | RhoG ELISA试剂盒 | Biosource | MBS9324983 |
| GST-pulldown | 谷胱甘肽Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0756-01 |
| 5′-二磷酸鸟苷钠盐（GDP） | Sigma-Aldrich | G7127 | |
| 5′-O-(3-硫代三磷酸)鸟苷四锂盐（GTPγS） | Sigma-Aldrich | G8634 | |
| 免疫共沉淀 | GammaBind G Sepharose珠子 | GE Healthcare | 17-0885-01 |
| Strep pulldown | 脱硫生物素洗脱缓冲液 | Sigma-Aldrich | D1411 |
| FLAG免疫沉淀 | 抗FLAG M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220 |
| 3xFLAG肽 | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| 蛋白浓缩 | Amicon 3 kDa截留过滤器 | EMD Millipore | UFC500396 |
| Western blot | NuPAGE Novex Tris-Acetate预制胶（3–8% 10孔） | Life Technologies | EA0375BOX |
| NuPAGE Novex Tris-Acetate预制胶（3–8% 12孔） | Life Technologies | EA03752BOX | |
| NuPAGE Novex Bis-Tris预制胶（12% 10孔） | Life Technologies | NP0341BOX | |
| NuPAGE Novex Bis-Tris预制胶（12% 12孔） | Life Technologies | NP0342BOX | |
| NuPAGE Novex Bis-Tris预制胶（4–12% 10孔） | Life Technologies | NP0321BOX | |
| BLUeye预染蛋白Marker | Geneflow Ltd | S6-0024 | |
| Immobolin PVDF膜 | Millipore | IPFL00010 | |
| Hyperfilm ECL胶片 | GE Healthcare | 28–9068 | |
| ECL Western blot分析系统 | GE Healthcare | RPN2109 | |
| SILAC | 透析胎牛血清 | Life Technologies | 26400-044 |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | G7513 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| GEF诱导表达与Rac1活性检测 | dox浓度1 μg/ml、诱导24-48小时、乙醇溶剂对照、GEF*突变体对照、PAK-CRIB/Rhotekin pulldown对照 阅读提示：Figure 1a,b图注及Methods中Generation of cell lines和Active GTPase pulldown小节 |
| 细胞形态、迁移和散射实验 | 细胞系（NIH3T3/A431/MDCKII）、dox诱导24小时、每条件150个细胞计数、EGF 100 ng/ml/HGF 10 ng/ml处理及时间点 阅读提示：Figure 1c-f、Figure 2图注及Methods中Analysis of cell morphology、Cell scattering assays和ORIS migration assay小节 |
| SILAC筛选与Rac1相互作用组 | SILAC标记倍增次数、五重SILAC设计和反向SILAC、±1.3倍变化cutoff、SF-TAP纯化步骤 阅读提示：Figure 3a及Supplementary Fig. 3、Methods中SILAC labelling and protein identification和StrepII-FLAG tandem affinity purification小节 |
| FLII敲低与迁移/收缩功能实验 | siRNA序列和浓度、转染试剂、两次反向转染时间、dox诱导时间、blebbistatin 100 μM/Y27632 10 μM处理24小时 阅读提示：Figure 6、Figure 7、Figure 8图注及Methods中Transient transfection of siRNA、ORIS migration assay和Fibroblast-collagen matrix contraction assay小节 |
| P-Rex1-FLII和Rac1-FLII互作验证 | GST-Rac1核苷酸加载条件（GDP 100 μM/GTPγS 1 mM）、抗体稀释比例、PLA探针和检测试剂、FLII结构域突变体 阅读提示：Figure 3b-g、Figure 4、Figure 5图注及Methods中GST-pulldown、Immunoprecipitation and pulldowns和Duolink in situ proximity ligation assay小节 |