构建p16INK4a缺失的klotho小鼠并评估衰老表型
验证p16INK4a缺失能否逆转klkl/kl小鼠的加速衰老表型。
将杂合klotho（klkl/+）小鼠与杂合p16INK4a敲除（p16+/−）小鼠杂交，获得klkl/klp16−/−小鼠，比较其与klkl/kl及klkl/klp16+/−同窝小鼠的生长、骨质疏松、肺气肿、肠壁和皮肤萎缩及最大寿命。
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p16(INK4a)肿瘤抑制因子缺失逆转klotho小鼠的衰老表型
Ablation of the p16(INK4a) tumour suppressor reverses ageing phenotypes of klotho mice.
实验完整度
高含klotho小鼠遗传杂交、寿命与组织表型分析、BLI、RT-qPCR、Western blot、ChIP及启动子荧光素酶报告等多层功能与机制验证
主要模型
klkl/kl低效等位基因突变小鼠 p16INK4a敲除小鼠及klkl/klp16−/−小鼠 原代小鼠肾小管上皮细胞（mRTECs） 原代人肾小管上皮细胞（hRTECs）
重点核对
klkl/kl与p16−/−杂交所得klkl/klp16−/−小鼠的基因型及遗传背景（98.375% C57BL/6J, 1.625% C3H/J） 生存分析中各基因型及性别的样本量与最大寿命终点 p16-luc小鼠活体生物发光成像检测p16INK4a表达，D-luciferin 75 mg kg−g，腹腔注射，曝光5 min 顺铂12 mg kg−g腹腔注射，隔日一次共三次，持续一周的肾损伤模型 荧光素酶报告实验中α-klotho启动子片段长度及E2F结合位点突变或缺失
摘要
p16INK4a肿瘤抑制因子在干细胞/祖细胞中执行细胞衰老方面具有既定作用，这被认为促成机体衰老。然而，由于p16INK4a敲除小鼠因癌症而早死，p16INK4a是否降低寿命仍不清楚。在这里我们显示，在α-klotho衰老抑制基因低效等位基因纯合突变小鼠（klkl/kl）中，加速衰老表型被p16INK4a缺失所挽救。令人惊讶的是，这是由于klkl/kl小鼠中α-klotho表达的恢复，而在α-klotho敲除小鼠（kl−/−）中缺失p16INK4a时并不会发生，提示p16INK4a是α-klotho表达的上游调节因子。确实，p16INK4a通过阻断E2Fs的功能来抑制α-klotho启动子活性。这些结果，连同在整个衰老过程中p16INK4a表达水平与α-klotho表达水平呈负相关的观察，表明p16INK4a在衰老过程中下调α-klotho表达方面发挥此前未被认识的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- p16INK4a是否以及如何促成klotho小鼠的加速衰老表型，并是否降低哺乳动物寿命。
- 核心机制
- p16INK4a作为α-klotho表达的上游调节因子，通过阻断激活型E2F（E2F1/E2F3）的功能抑制α-klotho启动子活性，从而下调α-klotho表达并促进衰老表型。
- 主要证据
- klkl/klp16−/−小鼠中加速衰老表型及最大寿命得到改善，肾脏α-klotho mRNA和蛋白恢复；kl−/−小鼠中p16INK4a缺失不能逆转表型；mRTECs和hRTECs启动子荧光素酶报告、ChIP及E2F1−/−E2F3a−/−小鼠肾脏α-klotho降低支持该机制。
- 研究意义
- 揭示了p16INK4a除诱导细胞衰老外，还通过下调α-klotho促进机体衰老的此前未被认识的通路，增进了对哺乳动物衰老表型发生和进展分子机制的理解，并为控制衰老表型提供了新可能。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测klkl/kl小鼠体内p16INK4a表达
检验α-klotho缺陷是否通过升高p16INK4a表达导致衰老表型。
将p16-luc小鼠引入klotho遗传背景，进行活体生物发光成像，并用qRT–PCR检测肾脏p16INK4a表达。
检测p16INK4a缺失后α-klotho表达及生化指标恢复
解释p16INK4a缺失逆转klkl/kl表型的生化基础。
检测klkl/klp16−/−小鼠肾脏α-klotho mRNA和蛋白、1α-羟化酶、血清1,25-二羟基维生素D、血清磷和钙、calpain-1活化及异位钙化，并在kl−/−小鼠中检验p16INK4a缺失的效果。
在顺铂肾损伤模型中检验p16INK4a对α-klotho的下调作用
在具有野生型α-klotho的小鼠中检验p16INK4a是否下调α-klotho表达。
用顺铂处理野生型和p16−/−小鼠，检测肾脏α-klotho表达、γH2AX foci及p16INK4a诱导。
启动子报告与ChIP验证p16INK4a–E2F–α-klotho机制
验证p16INK4a是否通过阻断E2F功能抑制α-klotho启动子活性。
在原代mRTECs和hRTECs中进行α-klotho启动子荧光素酶报告实验，共转染p16INK4a、E2F1或E2F3，突变E2F结合位点，并用ChIP检测内源E2F1/E2F3结合；检测E2F1−/−E2F3a−/−小鼠肾脏α-klotho表达。
在人肾小管上皮细胞中验证p16INK4a下调α-klotho
将小鼠机制扩展至人细胞。
比较早期与晚期传代hRTECs中α-klotho和p16INK4a表达，siRNA敲低p16INK4a或过表达p16INK4a，并进行人α-klotho启动子报告和ChIP分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物饲养 | CE-2正常饲料 | CLEA Inc. | -- |
| 骨X线摄影 | 富士工业X线胶片 | FUJIFILM Corporation | -- |
| SOFTEX CMB-2 X线设备 | SOFTEX CO., LTD. | -- | |
| 富士医用胶片冲洗机 | FUJIFILM Corporation | -- | |
| 生物发光成像 | D-荧光素钠盐 | -- | -- |
| PIXIS 1024B冷却CCD相机 | Princeton Instruments | PIXIS 1024B | |
| IMAGE-PRO PLUS | Media Cybernetics | -- | |
| 组织学与免疫荧光 | Alexa Fluor 488山羊抗小鼠抗体 | Molecular probes | -- |
| Alexa Fluor 546山羊抗兔抗体 | Molecular probes | -- | |
| Klotho抗体 | TransGenic Inc. | KO603 | |
| E-cadherin抗体 | Cell Signaling | 3195 | |
| γ-H2AX抗体 | Millipore | 05-636 | |
| 组织学 | 5%硝酸银 | -- | -- |
| 5%硫代硫酸钠 | -- | -- | |
| Kernechtrot染料 | -- | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Life Technologies | -- |
| SYBER Premix EX Taq系统 | TAKARA | -- | |
| Prism 7900HT实时PCR仪 | ABI | 7900HT | |
| SDS2.1软件 | ABI | -- | |
| 血清生化检测 | 磷酸盐检测试剂盒 | Serotec Co. Ltd. | UPi-L |
| 钙检测试剂盒 | AKJ Global Technology | Ca-CPZIII | |
| BUN检测试剂盒 | LSI medience Co. Ltd. | LQ UN rate (A) II | |
| 细胞培养 | 胶原酶 | Sigma | -- |
| 多聚-L-赖氨酸包被培养皿 | Corning | -- | |
| 正常人肾小管上皮细胞 | Lonza | -- | |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂混合物 | Nacalai tesque | -- |
| 增强化学发光系统 | GE Healthcare | -- | |
| α-Klotho抗体 | TransGenic Inc. | KO603 | |
| Calpain-1（μ-Calpain）抗体 | Enzo | ALX-804-050-R100 | |
| α-tubulin抗体 | Sigma | T9026 | |
| Vinculin抗体 | Sigma | V9131 | |
| ChIP | EZ-ChIP试剂盒 | Millipore | -- |
| 抗小鼠E2F1抗体 | Santa Cruz | sc-193X | |
| 抗小鼠E2F3抗体 | Santa Cruz | sc-878X | |
| 抗人E2F1抗体 | Santa Cruz | sc-193X | |
| 抗人E2F3抗体 | Santa Cruz | sc-878X | |
| 兔IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| QIAquick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- | |
| RNA干扰 | RNAiMAX转染试剂 | Life Technologies | -- |
| 荧光素酶报告实验 | Quick Change定点突变试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| PGL3 basic萤火虫荧光素酶报告质粒 | Promega | -- | |
| X-treamGENE9 DNA转染试剂 | Roche | -- | |
| 荧光素酶检测系统试剂盒 | Promega | -- | |
| 顺铂处理 | 顺铂（顺式二氨二氯铂II） | Wako pure chemical | -- |
| 统计 | GraphPad Prism软件5.01版 | GraphPad Software Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| klotho与p16INK4a遗传杂交及衰老表型分析 | 小鼠基因型、同窝对照选择、遗传背景（98.375% C57BL/6J, 1.625% C3H/J）、表型检测年龄和性别 阅读提示：Methods的Mice小节及Figures 1、2图注 |
| 生存分析 | 各基因型雄性和雌性的样本量、最大寿命判定和统计方法 阅读提示：Figure 1b图注及Methods的Mice小节 |
| 生物发光成像检测p16INK4a表达 | p16-luc小鼠周龄和性别、D-luciferin剂量75 mg kg−g、注射后5 min开始记录、曝光5 min 阅读提示：Methods的Bioluminescence imaging小节及Figure 3图注 |
| 顺铂诱导肾损伤模型 | 顺铂剂量12 mg kg−g、腹腔注射、隔日一次共三次、持续一周 阅读提示：Methods的Cisplatin treatment小节及Supplementary Fig. 4 |
| α-klotho启动子荧光素酶报告与ChIP | 启动子片段长度（小鼠1,035核苷酸上游；人−1,028 wt/−473 wt）、E2F位点突变或缺失、E2F1/E2F3质粒用量、抗体和阴性对照 阅读提示：Methods的Luciferase–reporter assays和ChIP analysis小节及Figures 6、7图注 |
| 原代肾小管上皮细胞培养 | mRTECs来源小鼠周龄6至10周龄雄性、hRTECs来源Lonza、传代状态 阅读提示：Methods的Cell culture小节及Figures 6、7图注 |