iMethyl-SILAC标记策略的建立与验证
验证新标记策略能特异性识别甲基化肽段，降低假阳性率。
用L-Met或L-Met-13C4标记Jurkat细胞，比较heavy methyl-SILAC和iMethyl-SILAC，通过LC-MS/MS分析甲基-SILAC配对。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
原代T细胞中精氨酸甲基化的全面鉴定揭示其在细胞信号传导中的调控作用
Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling.
实验完整度
高包含Jurkat细胞和原代T细胞的质谱鉴定，以及原代T细胞刺激后的定量蛋白质组学分析，具有独立证据层级和功能验证。
主要模型
Jurkat T细胞系 人原代CD4+ T淋巴细胞
重点核对
Jurkat细胞和原代T细胞分别用L-Met或L-Met-13C4标记，混合后经胰蛋白酶、糜蛋白酶或GluC消化，用D5A12或MeR4100抗体富集甲基化肽段，LC-MS/MS鉴定。 原代CD4+ T细胞刺激条件：抗CD3包被（20 μg/ml OKT3）、抗CD28（1 μg/ml CD28.2）和IL-2（50 ng/ml），培养7-9天。 未刺激与刺激的原代T细胞来自9名供体，分为3个生物学重复，每个重复合并3名供体的未刺激细胞。 甲基化肽段鉴定标准：iProphet概率>0.25，ModLS评分>8，甲基-SILAC配对质量误差<9.3 ppm，FDR 0.93%。
摘要
蛋白质精氨酸甲基化对免疫功能的调控影响几乎未知。本文应用一种新方法——异甲硫氨酸甲基-SILAC——结合抗体介导的精氨酸甲基化肽段富集，通过质谱鉴定人T细胞中的甲基化肽段。该方法从1257个组织特异性和管家蛋白中鉴定了2502个精氨酸甲基化位点。我们发现T细胞抗原受体信号机器的组分以及几个调控T细胞命运决定的关键转录因子在精氨酸上被甲基化。此外，我们证明在细胞刺激过程中，一组对T细胞分化至关重要的蛋白质的精氨酸甲基化化学计量发生变化。我们的数据提示蛋白质精氨酸甲基转移酶在T细胞活化和分化中发挥关键调控作用，为T细胞生物学开辟了新的研究领域。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 蛋白质精氨酸甲基化在T细胞中的整体规模、动态变化及其对T细胞信号传导和分化的调控作用是什么？
- 核心机制
- 蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）通过催化T细胞信号机器和转录因子等蛋白的精氨酸甲基化，并在T细胞刺激过程中改变特定蛋白的甲基化化学计量，从而调控T细胞活化和分化。
- 主要证据
- 通过iMethyl-SILAC在Jurkat和原代T细胞中鉴定出2502个精氨酸甲基化位点（来自1257个蛋白）；在原代CD4+ T细胞刺激前后定量了365个甲基化肽段，发现9.6%的肽段甲基化占据率发生变化；这些变化富集于mRNA剪接因子。
- 研究意义
- 将精氨酸甲基化提升为与乙酰化、磷酸化和泛素化同等重要的翻译后修饰，为T细胞生物学和免疫疾病研究开辟了新领域。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
T细胞精氨酸甲基化蛋白质组的全面鉴定
大规模鉴定Jurkat和原代T细胞中的精氨酸甲基化位点和蛋白。
iMethyl-SILAC标记的Jurkat和原代T细胞混合，用三种蛋白酶消化，抗体富集甲基化肽段，LC-MS/MS鉴定。
T细胞活化过程中精氨酸甲基化化学计量的定量分析
探究T细胞刺激是否引起精氨酸甲基化占据率的变化。
原代CD4+ T细胞未刺激或刺激后，用常规SILAC标记，富集甲基化肽段，并分析未甲基化肽段以校正蛋白表达变化，计算甲基化占据率变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 缺乏L-甲硫氨酸、L-精氨酸和L-赖氨酸的RPMI 1640 | Dundee cell products | -- |
| 透析胎牛血清 | GIBCO | -- | |
| SILAC标记 | L-甲硫氨酸-13C4 | Sigma Isotec | -- |
| L-甲硫氨酸-甲基-13CD3 | Sigma | -- | |
| L-精氨酸-13C6,15N4 | Cambridge Isotope Laboratories | -- | |
| L-赖氨酸-13C6,15N2 | Cambridge Isotope Laboratories | -- | |
| 原代T细胞分离 | Dynal分离试剂盒 | Life Technologies | -- |
| T细胞刺激 | 抗CD28抗体（克隆CD28.2） | BioLegend | -- |
| 白介素-2 | AbD Serotec | -- | |
| 植物血凝素 | Sigma | -- | |
| 细胞培养 | 青霉素和链霉素 | PAA | -- |
| 肽段脱盐 | Sep-Pak C18柱 | Waters | -- |
| 免疫亲和纯化 | D5A12抗体 | Cell Signaling Technology | 8015 |
| MeR4100抗体 | Cell Signaling Technology | 8711 | |
| 蛋白A琼脂糖珠 | Roche | -- | |
| HILIC分级 | ZIC HILIC色谱柱 | Merck | -- |
| 质谱分析 | Ultimate RSLC纳米液相色谱 | Dionex | -- |
| Q Exactive质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| Easy-Column色谱柱 | Thermo Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| iMethyl-SILAC标记 | 标记氨基酸浓度（L-Met或L-Met-13C4 0.1 mM，L-Arg 0.29 mM，L-Lys 0.219 mM），标记时间（5-7个细胞倍增） 阅读提示：Methods: Labelling of cells by SILAC |
| 原代T细胞刺激 | 刺激条件（抗CD3 20 μg/ml，抗CD28 1 μg/ml，IL-2 50 ng/ml），刺激时间（7-9天） 阅读提示：Methods: Labelling of cells by SILAC, Figure 3a |
| 甲基化肽段富集 | 抗体用量（D5A12 200 μg或MeR4100 270 μg），肽段与抗体比例，裂解液组成（8 M尿素，20 mM Tris pH8） 阅读提示：Methods: Enrichment of arginine-methylated peptides |
| 质谱数据采集 | 质谱参数（分辨率70,000，HCD碎裂，Top10方法），液相梯度（5-44% B，130分钟） 阅读提示：Methods: Mass spectrometry data acquisition |
| 数据分析 | FDR阈值（肽段水平5%，甲基化肽段0.93%），定量方法（MaxQuant，LIMMA） 阅读提示：Methods: Mass spectrometry data analysis |