DNA损伤转录组分析
鉴定DNA损伤后差异表达的lncRNA。
对HCT116 p53+/+细胞进行5-FU处理0、4、12 h，提取polyA+ RNA进行链特异性配对末端RNA-seq，使用Cufflinks/Cuffmerge组装转录本，Cuffdiff2分析差异表达。
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人类p53转录网络的全基因组分析揭示lncRNA抑癌特征
Genome-wide analysis of the human p53 transcriptional network unveils a lncRNA tumour suppressor signature.
实验完整度
高HCT116细胞RNA-seq与ChIP-seq整合、ASO敲低功能验证、小鼠MEF保守性分析、结直肠癌样本表达验证
主要模型
HCT116 p53+/+ 结直肠癌细胞系 HCT116 p53−/− 结直肠癌细胞系 p53+/+ 和 p53−/− 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF) 结直肠癌患者肿瘤及配对正常组织样本
重点核对
5-FU处理HCT116细胞的浓度350 μM及时间0、4、12 h 多柔比星处理浓度500 nM及时间 ASO转染36 h后5-FU处理12 h qRT-PCR验证至少3个生物学重复 结直肠癌队列35例肿瘤与配对正常组织
摘要
尽管p53在癌症中的相关性无可争议，但将内源性p53活性与人类细胞中lncRNA表达联系起来全基因组研究仍然缺失。在这里，通过整合RNA-seq与DNA损伤下人类癌细胞系的p53 ChIP-seq分析，我们定义了一组高置信度的18个受p53转录调控的lncRNA。我们证明其中两个受p53调控的lncRNA是p53有效结合其部分靶基因所必需的，它们调节p53转录网络并促进DNA损伤诱导的细胞凋亡。我们还显示p53-lncRNA在结直肠癌样本中表达降低，构成具有高诊断价值的抑癌特征。因此，受p53调控的lncRNA建立了一个正调控反馈环路，增强p53的抑癌活性。此外，由p53调控的lncRNA定义的特征支持它们在临床上作为生物标志物和治疗靶点的潜在用途。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 内源性p53在DNA损伤下如何全基因组调控lncRNA表达，以及这些lncRNA是否参与p53转录网络和抑癌功能。
- 核心机制
- p53直接转录激活PR-lncRNA-1和PR-lncRNA-10，这两个lncRNA反过来促进p53与其部分靶基因启动子区p53RE的结合，形成正反馈环路增强p53转录活性，促进凋亡和细胞周期阻滞。
- 主要证据
- HCT116细胞RNA-seq和p53 ChIP-seq整合鉴定18个高置信度p53调控lncRNA；ASO敲低PR-lncRNA-1/10后p53 ChIP和qRT-PCR显示靶基因结合和表达下降；增殖、凋亡和细胞周期实验显示敲低lncRNA减少凋亡、增加增殖和S期细胞；结直肠癌样本中lncRNA表达降低。
- 研究意义
- 揭示了p53通过lncRNA的正反馈调控机制，p53调控lncRNA特征在结直肠癌中具有诊断潜力，并可能作为生物标志物和治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
p53全基因组结合位点鉴定
鉴定p53直接结合的基因组区域，区分直接调控靶标。
对未处理和5-FU处理12 h的HCT116 p53+/+细胞进行p53 ChIP-seq，使用p53多克隆抗体FL393，分析p53结合位点及其与转录组的关系。
p53调控lncRNA的验证
验证候选lncRNA的p53依赖性和DNA损伤诱导表达。
在HCT116 p53+/+和p53−/−细胞中，未处理或5-FU处理4、12 h，通过qRT-PCR验证lncRNA表达；并在MEFs中验证保守性。
PR-lncRNA-1和PR-lncRNA-10的功能敲低
研究这两个lncRNA对p53转录网络和细胞表型的影响。
使用ASO敲低PR-lncRNA-1或PR-lncRNA-10，转染36 h后5-FU处理12 h，进行微阵列分析基因表达变化；并通过qRT-PCR验证。
p53结合能力与转录激活检测
验证lncRNA敲低对p53结合靶基因启动子和靶基因表达的影响。
在ASO敲低PR-lncRNA-1或PR-lncRNA-10后，进行p53 ChIP-qPCR检测SERPINB5、CDKN1A、BCL2L1、BBC3等基因的p53结合，并用qRT-PCR检测其mRNA水平。
细胞增殖、凋亡和细胞周期表型分析
评估lncRNA对细胞存活、凋亡和细胞周期的影响。
ASO敲低lncRNA后，用多柔比星或5-FU处理，通过MTS assay检测增殖，annexin V/7-AAD和caspase 3/7检测凋亡，PI染色流式检测细胞周期。
临床样本中lncRNA表达与诊断价值分析
验证p53调控lncRNA在结直肠癌中的表达变化及诊断潜力。
在35对结直肠癌肿瘤和配对正常组织中用qRT-PCR检测lncRNA表达，进行ROC分析和逻辑回归建模。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA损伤处理 | 5-氟尿嘧啶 | Sigma | F6627 |
| 盐酸多柔比星 | Sigma | D1515 | |
| Western blot | 抗p53抗体(DO-1) sc-126 | -- | sc-126 |
| 抗磷酸化p53 (S15)抗体 | Cell Signaling | 11/2012 | |
| 抗GAPDH抗体mAbcam 9484 | Abcam | 9484 | |
| p53 ChIP | p53多克隆抗体FL393 | Santa Cruz | SC-6243 |
| ChIP | Dynabeads磁珠 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| Bioruptor U-200超声破碎仪 | -- | -- | |
| 细胞增殖检测 | CellTiter96 Aqueous非放射性细胞增殖检测(MTS)试剂盒G3581 | Promega | G3581 |
| 凋亡检测 | caspase-Glo 3/7试剂 | Promega | -- |
| 凋亡检测试剂盒I | BD Biosciences | cat-559763 | |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| FACSCalibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| RNA荧光原位杂交 | Stellaris荧光探针 | Biosearch Technologies | -- |
| RNA提取 | RNEASY MINI试剂盒 | Qiagen | -- |
| 逆转录 | Superscript逆转录酶 | Life Technologies | -- |
| 微阵列分析 | Affymetrix人类转录组芯片2.0 | Affymetrix | -- |
| ASO合成 | Applied Biosystems 380B自动DNA合成仪 | PerkinElmer Life and Analytical Sciences-Applied Biosystems | -- |
| 荧光素酶检测 | FLUOstar Optima发光检测仪 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| DNA损伤处理 | 5-FU浓度350 μM；多柔比星浓度500 nM；处理时间0、4、12 h 阅读提示：Methods: Cell lines and DNA-damage treatment |
| RNA-seq | HCT116 p53+/+细胞；5-FU处理12 h包含两个独立样本；polyA+ RNA；HiSeq 2000测序150 bp 阅读提示：Methods: RNA-seq analysis |
| p53 ChIP-seq | HCT116 p53+/+细胞；5-FU处理12 h；p53抗体FL393 (SC-6243)；1%甲醛交联10 min 阅读提示：Methods: p53 chromatin immunoprecipitation |
| ASO敲低 | ASO转染36 h；5-FU处理12 h；ASO浓度文中未明确说明 阅读提示：Methods: qPCR primers and ASOs; Results: PR-lncRNAs required for efficient binding of p53 to gene targets |
| 细胞增殖、凋亡和细胞周期 | 多柔比星150 nM处理12 h；5-FU 350 μM处理12 h；MTS assay接种1000细胞/孔；annexin V-7AAD；caspase 3/7；PI染色 阅读提示：Methods: Cell proliferation assays; Apoptosis and cell cycle analysis; Figure 6 legend |
| 临床样本分析 | 35对结直肠癌肿瘤和配对正常组织；qRT-PCR；ROC分析和逻辑回归 阅读提示：Methods: Human samples; Figure 7 legend |