大鼠食管脱细胞支架制备与表征
制备保留天然结构和生物活性的脱细胞食管支架
采用 submerged luminal perfusion system，以脱氧胆酸钠、去离子水和DNase-I处理大鼠食管，并进行组织学、免疫组化、SEM、CT和生物力学评价
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
大鼠组织工程食管的实验性原位移植
Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats.
实验完整度
高包含体外支架表征、CAM血管生成、皮下移植免疫原性、原位移植及多种功能与机制验证
主要模型
大鼠脱细胞食管支架 大鼠骨髓间充质基质细胞（BM-MSCs） 免疫健全Sprague-Dawley大鼠原位移植模型
重点核对
脱细胞后无完整细胞核且MHC I/II阳性细胞完全消失 支架保留胶原I/IV、弹性蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白 接种细胞在支架上自发表达上皮和肌肉标志物 原位移植14天后所有动物存活且移植物通畅 取出移植物显示上皮、肌肉、神经和血管再生
摘要
组织工程食管支架可能对治疗儿童和成人良性或恶性疾病（如癌、创伤或先天畸形）非常有用。在此，我们在灌注生物反应器内将大鼠食管脱细胞，以创建模拟天然结构、抵抗机械应力并诱导血管生成的生物相容性大鼠生物支架。接种的同种异体间充质基质细胞自发分化（通过基因、蛋白和功能评估证实）为上皮样和肌肉样细胞。将重 seeded 支架用于免疫健全大鼠的整个颈部食管原位替换。所有动物均存活14天研究期，移植物通畅且功能正常，且体重增加显著多于假手术动物。取出的移植物显示食管所有主要细胞和组织成分的再生，包括功能性上皮、肌纤维、神经和血管。我们认为所呈现的组织工程食管支架是迈向生物工程食管临床应用的重要一步。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否制备脱细胞食管支架并接种间充质基质细胞，实现大鼠颈部食管原位替换并恢复功能？
- 核心机制
- 脱细胞支架保留天然ECM结构和生物活性分子，诱导血管生成，并促使接种的BM-MSCs自发分化为上皮样和肌肉样细胞，支持组织再生。
- 主要证据
- 灌注脱细胞食管支架经组织学、SEM、CT、MRI示踪和生物力学测试表征；CAM实验显示促血管生成；皮下移植显示低免疫原性；原位移植14天后移植物通畅，上皮、肌纤维、神经和血管再生。
- 研究意义
- 作者认为该组织工程食管支架是迈向生物工程食管临床应用的重要一步。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
支架生物力学与血管生成评价
验证支架的机械性能和促血管生成能力
进行burst pressure、应力测试、纵向拉伸和distensibility测试，并用CAM assay评价血管生成
支架免疫原性评价
评估脱细胞支架是否引起不良免疫反应
将脱细胞支架、天然食管和假手术组皮下移植到同种异体大鼠，5天后组织学和巨噬细胞CD68染色
BM-MSCs分离、接种与分化评价
验证支架细胞相容性和接种细胞的分化能力
分离大鼠BM-MSCs，GFP标记后接种于支架，培养3周，进行形态学、增殖、基因表达、钙流和电阻检测
原位移植与体内功能评价
验证组织工程食管原位替换后的通畅性和组织再生
将接种BM-MSCs的脱细胞支架移植到免疫健全大鼠颈部食管，14天后进行组织学、免疫组化、CT、SEM、TEM和biotin assay评价
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证免疫效应
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 脱细胞 | 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich | -- |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | -- | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | Gibco, Life Technologies | -- | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco, Life Technologies | -- | |
| 灌注系统 | 20G静脉导管 | Terumo | -- |
| 6-0 Prolene缝线 | Ethicon | -- | |
| 蠕动泵 | Ecoline, Ismatec | -- | |
| 组织学 | Masson三色染色 | Sigma-Aldrich | -- |
| DAPI | Sigma-Aldrich | -- | |
| 免疫组化 | 层粘连蛋白抗体 | Abcam | Ab11575 |
| 弹性蛋白抗体 | Abcam | Ab21610 | |
| 纤连蛋白抗体 | Abcam | Ab6328 | |
| I型胶原抗体 | Abcam | Ab34710 | |
| IV型胶原抗体 | Abcam | Ab6586 | |
| MHC I抗体 | Abcam | Ab22367 | |
| MHCII抗体 | Abcam | Ab23990 | |
| MyoD1抗体 | Abcam | ab16148 | |
| 泛角蛋白（C11）抗体 | Cell Signaling Technology | 4545 | |
| Gap43抗体 | Cell Signaling Technology | 8945 | |
| Desmin抗体 | Cell Signaling Technology | 5332 | |
| 血管性血友病因子抗体 | Abcam | Ab6994 | |
| β-III-微管蛋白抗体 | Covance | MMS-435P | |
| VEGF抗体 | Abcam | Ab1316 | |
| Ki-67抗体 | Fisher Scientific | SP6 | |
| ZO-2抗体 | Cell Signaling Technology | 2847-S | |
| 山羊抗兔二抗 | Life Technologies | a11037 | |
| 山羊抗鼠二抗 | Life Technologies | a11032 | |
| 含DAPI的Fluoroshield封片剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Micro-CT | Quantum FXmCT微型CT | Caliper, Perkin Elmer Inc. | -- |
| SEM | JSM6490扫描电子显微镜 | JEOL | -- |
| MRI | 9.4 T磁共振扫描仪 | Varian inc, Yarnton | -- |
| CAM assay | 明胶海绵 | Upjohn | -- |
| 重组VEGF | R&D Systems | -- | |
| 生物力学 | 注射泵 | Harvard Apparatus | PHD2000 |
| 压力传感器 | Hugo Sachs Elektronik | P1500 | |
| 细胞培养 | 低糖DMEM | Invitrogen, Life Technologies | -- |
| 胎牛血清 | Invitrogen, Life Technologies | -- | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Invitrogen, Life Technologies | -- | |
| GFP电转 | Neon电转系统 | Invitrogen, Life Technologies | -- |
| DNA定量 | DNeasy试剂盒 | Qiagen | -- |
| Nanodrop分光光度计 | Saveen Werner | -- | |
| 巨噬细胞染色 | CD68抗体 | Abcam | 31630 |
| Alexa Fluor 594二抗 | Life Technologies | A-11005 | |
| Hoechst核染料 | -- | -- | |
| qPCR | RNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| 7500 Fast实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 钙成像 | Fluo-3/AM钙指示剂 | Invitrogen | -- |
| 电阻测量 | EVOM2电阻测量仪 | World Precision Instruments | -- |
| 原位移植 | 7-0聚丙烯缝线 | Ethicon | -- |
| 6-0聚丙烯缝线 | Ethicon | -- | |
| Ethilon 4-0缝线 | Ethicon | -- | |
| TEM | Leica EM UC 6超薄切片机 | Leica | -- |
| Tecnai 12 Spirit Bio TWIN透射电子显微镜 | FEI company | -- | |
| Biotin assay | 生物素（长臂）NHS | BioNordika | -- |
| DyLight 594链霉亲和素 | Bionordika | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 脱细胞 | 脱氧胆酸钠浓度4% w/w、DNase-I 2,000 kunitz units、灌注流速9 ml/min、两轮30分钟循环 阅读提示：Methods: Decellularization of oesophagus |
| 原位移植 | 移植段长度15 mm、缝合方式7-0单丝间断缝合、术后饮食方案、观察终点14天、n=10 阅读提示：Methods: Orthotopic transplantation；Figure 7 legend |
| BM-MSC接种 | 细胞代次第4代、接种密度80,000 cells/cm²、接种后静态50分钟、培养3周 阅读提示：Methods: BM-MSC isolation and seeding to scaffold；Tubular cell seeding |
| 皮下移植免疫原性 | 每组n=3、移植后5天取材、CD68抗体1:800 阅读提示：Methods: Subcutaneous transplantation；Macrophage staining and visualization；Figure 5 legend |
| CAM assay | 支架1 mm³、阳性对照200 ng重组VEGF、孵化12天、血管计数 阅读提示：Methods: CAM assay；Figure 4n–r legend |
| 生物力学测试 | 应力测试10,000次循环/72小时、burst pressure注入速率8 ml/min、n=5 阅读提示：Methods: Burst pressure and stress test；Figure 4s–w legend |