激酶抑制剂双盲筛选
鉴定增强或抑制重编程的激酶抑制剂。
用244种细胞透性蛋白激酶抑制剂处理4F转导的Oct4-GFP MEFs，计数GFP+集落并用AP染色鉴定屏障命中和必需命中。
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激酶抑制剂筛选鉴定重编程和iPS细胞生成的小分子增强剂
A kinase inhibitor screen identifies small-molecule enhancers of reprogramming and iPS cell generation.
实验完整度
高包含激酶抑制剂筛选、siRNA敲低、iPSC多能性验证、嵌合体及致瘤实验、Western blot机制验证
主要模型
Oct4-GFP转基因小鼠MEFs 4F逆转录病毒转导的MEFs 抑制剂来源的iPSC克隆 mESCs
重点核对
抑制剂筛选在96孔板中每孔接种3,000个4F转导MEFs，从转导后第3天起每2天加入2 μM抑制剂 二次筛选用1和2 μM两个浓度，B6、B8和B10在低至0.5 μM时仍有效 siRNA转染50 nM，4F转导后第0天和第5天各转染一次 B6处理1 μM 2天检测AurkA蛋白和GSK3β Ser9磷酸化 MLN8237 10 nM处理在第3天加入，10天后计数GFP+集落
摘要
体细胞可以被重编程为胚胎干细胞样诱导多能干细胞（iPSCs），但该过程效率低，且控制重编程的分子机制仍不清楚。本文进行了抑制剂筛选，以鉴定增强重编程或构成重编程屏障的激酶。p38、肌醇三磷酸3-激酶和Aurora A激酶的抑制剂能显著增强iPSC生成，且经抑制剂处理的体细胞来源的iPSCs能达到完全重编程状态。用短干扰RNA敲低靶激酶证实它们作为屏障基因发挥作用。Aurora A激酶在中心体活性和纺锤体组装中起作用，在重编程过程中高度诱导，并抑制Akt介导的GSK3β失活，导致重编程效率受损。总之，结果不仅鉴定了增强iPSC生成的新化合物，也为Aurora A激酶在重编程过程中的功能提供了新见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哪些激酶构成或增强体细胞重编程为iPSCs的屏障，以及Aurora A激酶如何影响重编程效率。
- 核心机制
- Aurora A激酶在重编程中高度诱导，抑制Akt介导的GSK3β Ser9磷酸化，使GSK3β保持活性状态，从而限制重编程效率；抑制Aurora A可促进GSK3β磷酸化失活并增强iPSC生成。
- 主要证据
- 244种激酶抑制剂双盲筛选鉴定B4、B6、B8、B10增强iPSC生成；siRNA敲低Mapk11、ItpkA、Stk6和Syk证实屏障基因作用；抑制剂来源iPSCs表达Nanog、SSEA1、Oct4-GFP和AP，形成EB三胚层分化、致瘤实验和嵌合体；Western blot显示B6和MLN8237增加phospho-GSK3β(Ser9)和phospho-Akt(Ser473)，AurkA D274A突变体和siRNA验证。
- 研究意义
- 鉴定增强iPSC生成的新化合物和新屏障激酶靶点，并为Aurora A激酶在重编程中的功能提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
二次筛选和剂量验证
确认初筛屏障命中能显著增强iPSC生成。
用较大孔和1、2 μM两个浓度复筛11个屏障命中，并测试0.5 μM剂量反应和联合处理。
siRNA敲低验证靶激酶
验证抑制剂靶激酶是否作为屏障基因发挥作用。
针对B6、B8、B10潜在靶点设计siRNAs，转染MEFs后4F转导，计数GFP+集落。
iPSC多能性验证
排除抑制剂处理的细胞仅启动Oct4而未达到完全重编程状态。
对抑制剂来源iPSC克隆进行AP染色、Nanog和SSEA1免疫染色、全基因组mRNA表达谱、EB分化、畸胎瘤形成和嵌合体实验。
Aurora A–Akt–GSK3β机制验证
确定AurkA抑制增强重编程的分子机制。
B6和MLN8237处理4F转导MEFs，检测AurkA、phospho-GSK3β(Ser9)、phospho-Akt(Ser473)；用AurkA D274A突变体、siRNA和GSK3β过表达验证。
AurkA抑制对细胞周期和mESC自我更新的影响
评估AurkA抑制剂是否通过细胞周期或影响mESC自我更新起作用。
B6或MLN8237处理4F转导MEFs后进行PI染色流式细胞周期分析；B6处理mESCs在含或不含LIF条件下培养4天，进行AP染色和RT-qPCR。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Invitrogen | 11995-065 |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| 胎牛血清 | Hyclone | -- | |
| 白血病抑制因子 | Millipore | ESG1107 | |
| 逆转录病毒转导 | Lipofectamine转染试剂 | Invitrogen | 18324-012 |
| PLUS试剂 | Invitrogen | 11514-015 | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 激酶抑制剂筛选 | 激酶抑制剂文库 | Calbiochem | 539744-1EA; 539745-1EA; 539746-1EA |
| 碱性磷酸酶染色 | Vector红色AP底物试剂盒I | Vector laboratories | SK5100 |
| siRNA转染 | Opti-MEM培养基 | Invitrogen | 11058-021 |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Western blot | MPER裂解缓冲液 | Pierce | 78503 |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Bio-Rad | 1620177 | |
| 抗小鼠Nanog抗体 | R&D Systems | AF2729 | |
| 抗人/小鼠SSEA1抗体 | R&D Systems | MAB2156 | |
| 抗肌动蛋白抗体 | Thermo Scientific | MS1295P0 | |
| 抗甲胎蛋白抗体 | Abcam | ab7751 | |
| 抗β III微管蛋白抗体 | R&D Systems | MAB1368 | |
| 抗α肌动蛋白抗体 | Sigma | A7811 | |
| 抗小鼠Aurora A激酶抗体 | Bethyl Labs | A300-072A | |
| 抗人Aurora A激酶抗体 | Bethyl Labs | A300-071A | |
| 抗总GSK3β抗体 | Cell Signaling Technology | 9315S | |
| 抗磷酸化GSK3β (Ser9)抗体 | Cell Signaling Technology | 9323S | |
| 抗总Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 9272S | |
| 抗磷酸化Akt (Ser473)抗体 | Cell Signaling Technology | 9271S | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| Superscript II逆转录酶 | Invitrogen | -- | |
| SYBR green混合液 | Abgene | Ab-4166 | |
| 细胞增殖检测 | CellTiter 96 Aqueous One溶液 | Promega | G3580 |
| 流式细胞分析 | 碘化丙啶染色液 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 激酶抑制剂筛选 | MEFs代数P0–P4；每孔3,000细胞；4F转导后第3天加药；2 μM；每2天换液；第13天固定计数；DMSO对照；2.5倍阈值 阅读提示：Methods的Kinase library screening小节及Figure 1a图注 |
| 二次筛选和剂量验证 | 1和2 μM浓度；0.5 μM低剂量；B6、B8、B10联合各1 μM；第3天加药，10天后计数 阅读提示：Figure 2b图注及Supplementary Fig. S2b,e |
| siRNA敲低 | siRNA 50 nM；转染后3小时4F转导；第0天和第5天两次转染；约12天后计数GFP+集落 阅读提示：Methods的siRNA transfection of MEFs小节及Figure 3a–d图注 |
| iPSC多能性验证 | EB悬滴每滴4,000细胞20 μl；畸胎瘤注射1×10^7 cells/ml约150 μl，3–4周；囊胚注射12–18个iPSCs；mRNA microarray R2>0.95 阅读提示：Methods的EB formation and differentiation assay、Teratoma formation and chimera generation小节及Figure 4图注 |
| Aurora A–Akt–GSK3β机制验证 | B6 1 μM处理2天；MLN8237 10 nM；AurkA siRNA 50 nM转染2天；pMX-GSK3β与4F共转导；B6第3天加入，第12天计数 阅读提示：Figure 5和Figure 6图注及Methods相关小节 |
| 细胞周期和mESC自我更新评估 | B6多种浓度；MLN8237 10 nM和100 nM；PI染色每样本约20,000 events；mESCs在LIF+或LIF−培养4天；B6 0.5或1 μM 阅读提示：Figure 7图注及Methods的Cell cycle analysis小节 |