由谷胱甘肽化激活的DCAF11依赖性分子胶

DCAF11-dependent molecular glue degrader activated by glutathionylation.

作者信息Hojong Yoon, Franziska Wachter, Katharine A Barrett, Cyrus Jin, Anna Rodríguez-Pöhnlein, Justine C Rutter, Ryan J Lumpkin, Rebecca J Metivier, Katherine A Donovan, Kheewoong Baek, Yongying Jiang, Minwoo Lee, Robert W Kalis, Jianwei Che, Yuan Xiong, Eric S Fischer, Benjamin L Ebert

PMID42557329

期刊Nature

发布时间2026-09

DOI10.1038/s41586-026-10873-1

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实验完整度

高

包含体外重组蛋白、细胞系、CRISPR筛选、cryo-EM结构及PROTAC验证等多层级证据，并有功能与机制验证。

主要模型

Jurkat细胞 K562-Cas9 DDX18稳定性报告细胞 HEK293T细胞重组DDX18-DCAF11-DDB1-DDA1复合物

重点核对

M12浓度梯度（1-20 μM）与处理时间（6-18 h） DCAF11敲除或突变对M12诱导DDX18降解的影响谷胱甘肽化修饰依赖GST和GSH CRL4DCAF11复合物组分在CRISPR筛选中的富集 cryo-EM结构分辨率2.3 Å及关键结合位点突变验证

摘要

靶向蛋白质降解是一种强大的药理学策略，利用泛素-蛋白酶体系统消除疾病相关蛋白质，包括其他难以成药的蛋白质。在此，我们报告了一个无偏且广泛适用的平台，用于系统性发现跨多种E3连接酶的分子胶。利用多重质谱化学筛选，我们鉴定了M12，一种重编程E3连接酶DCAF11以降解DDX18的分子胶。机制上，M12作为前药，通过谷胱甘肽S-转移酶介导的谷胱甘肽化被激活。谷胱甘肽部分结合到DCAF11上进化保守的谷胱甘肽结合位点，暴露的M12部分促进新底物的招募。我们证明这种谷胱甘肽依赖性机制能够实现对多种蛋白质的靶向降解。总之，这些发现确立了代谢激活的化合物可以重定向E3连接酶功能，从而扩展靶向蛋白质降解和化学诱导邻近的范围。

多重IP-MS筛选平台建立与验证

验证多重E3连接酶与化合物池联用可无偏检测化合物诱导的新底物

将CRBN和DCAF15固定于珠上，与细胞裂解液及已知药物混合物（CC885、indisulam、dBET6）孵育，LC-MS鉴定富集蛋白；逐步增加化合物数量评估干扰。

大规模化合物库筛选鉴定DCAF11-DDX18分子胶

从5,000种化合物中识别诱导DDX18与DCAF11邻近的分子胶

7种E3连接酶（CRBN、DCAF1、DCAF5、DCAF11、KEAP1、VHL、SPOP）与5,000化合物（320/池）孵育，IP-MS检测富集蛋白；逐步缩小池并免疫印迹验证，鉴定M12。

M12诱导DDX18降解的细胞验证

确认M12通过DCAF11介导DDX18的泛素-蛋白酶体降解

Jurkat、Molt4、K562-Cas9报告细胞系经M12处理，检测DDX18蛋白和mRNA水平；使用蛋白酶体抑制剂、UBA1抑制剂、NAE1-UBA3抑制剂及溶酶体抑制剂；CRISPR敲除DCAF11。

CRISPR筛选鉴定降解通路组分

无偏鉴定M12诱导DDX18降解所需的关键基因

在K562-Cas9 DDX18稳定性报告细胞中进行全基因组和UPS聚焦CRISPR-Cas9敲除筛选，分选eGFP/mCherry比例最高和最低的5%细胞，测序分析sgRNA富集。

cryo-EM解析三元复合物结构

揭示M12、DCAF11和DDX18三元复合物的分子细节及GSH-M12的结合模式

在M12存在下纯化DDX18-DCAF11-DDB1ΔB-DDA1复合物，制备冷冻电镜样品，收集数据，解析结构至2.3 Å，建模并鉴定GSH-M12密度。

GSH-M12的酶学激活验证

证明M12经GST介导谷胱甘肽化成为活性分子胶

体外将M12与GST、GSH孵育，LC-MS/MS检测GSH-M12生成；TR-FRET检测DCAF11-DDX18邻近；化学合成GSH-M12 (HY-05)并验证其活性；体外泛素化实验。

DCAF11结合口袋与GSH结合验证

验证GSH直接结合DCAF11及关键残基对M12活性的重要性

TR-FRET使用BODIPY-GSH (HY-11)检测直接结合；竞争实验；DCAF11突变体（D309A/N311A/D328A等）免疫共沉淀；分析保守性。

基于M12的DCAF11 PROTAC开发与验证

验证M12作为DCAF11招募弹头可模块化降解多样靶蛋白

将M12与JQ1、SMARCA2配体、BRD9抑制剂、多激酶抑制剂连接生成HY-07、HY-08、HY-09、HY-10；在野生型和DCAF11-KO细胞中检测靶蛋白降解。

实验环节	名称	品牌	货号
细胞处理	dBET6	MedChemExpress	HY-112588
dBRD9	MedChemExpress	HY-117690
MLN7243	MedChemExpress	HY-100487
MLN4924	MedChemExpress	HY-70062
MG132	MedChemExpress	HY-13259
巴弗洛霉素A1	MedChemExpress	HY-100558
化合物筛选	5K骨架化合物库	MedChemExpress	HY-L902
蛋白纯化	Strep-Tactin XT Superflow树脂	IBA	2-4010-025
Anti-DYKDDDDK G1亲和树脂	Genscript	L00432
POROS 50HQ离子交换柱	Thermo Scientific	1255911
Superdex 200 Increase 10/300凝胶过滤柱	Cytiva	28990944
质谱样品制备	MagStrep Strep-Tactin XT磁珠	IBA	2-5090-010
胰蛋白酶/赖氨酸-C混合液，质谱级	Promega	V5072
C18固相萃取板	Thermo Scientific	60307
qPCR	RNeasy Plus试剂盒	QIAGEN	74134
iScript cDNA合成试剂盒	Bio-Rad	1708891
TaqMan基因表达预混液	Applied Biosystems	4369016
Western blot	RIPA裂解缓冲液	Thermo Scientific	89901
cOmplete蛋白酶抑制剂混合物	Sigma	11836170001
BCA蛋白测定试剂盒	Thermo Scientific	23227
Intercept (PBS)封闭缓冲液	LI-COR Biosciences	927-70001
免疫共沉淀	TransIT-LT1转染试剂	Mirus	MIR 2304
Pierce IP裂解缓冲液	Thermo Scientific	87787
Anti-DYKDDDDK磁珠琼脂糖	Thermo Scientific	A36797
NuPage LDS上样缓冲液	Invitrogen	NP0007
报告细胞系构建	MiniPrep试剂盒	Invitrogen	K210011
OptiMEM培养基	Gibco	31985070
体外谷胱甘肽化	还原型谷胱甘肽	Sigma	G4251

实验环节

名称

品牌

货号

细胞处理

dBET6

MedChemExpress

HY-112588

dBRD9

MedChemExpress

HY-117690

MLN7243

MedChemExpress

HY-100487

MLN4924

MedChemExpress

HY-70062

MG132

MedChemExpress

HY-13259

巴弗洛霉素A1

MedChemExpress

HY-100558

化合物筛选

5K骨架化合物库

MedChemExpress

HY-L902

蛋白纯化

Strep-Tactin XT Superflow树脂

IBA

2-4010-025

Anti-DYKDDDDK G1亲和树脂

Genscript

L00432

POROS 50HQ离子交换柱

Thermo Scientific

1255911

Superdex 200 Increase 10/300凝胶过滤柱

Cytiva

28990944

质谱样品制备

MagStrep Strep-Tactin XT磁珠

IBA

2-5090-010

胰蛋白酶/赖氨酸-C混合液，质谱级

Promega

V5072

C18固相萃取板

Thermo Scientific

60307

qPCR

RNeasy Plus试剂盒

QIAGEN

74134

iScript cDNA合成试剂盒

Bio-Rad

1708891

TaqMan基因表达预混液

Applied Biosystems

4369016

Western blot

RIPA裂解缓冲液

Thermo Scientific

89901

cOmplete蛋白酶抑制剂混合物

Sigma

11836170001

BCA蛋白测定试剂盒

Thermo Scientific

23227

Intercept (PBS)封闭缓冲液

LI-COR Biosciences

927-70001

免疫共沉淀

TransIT-LT1转染试剂

Mirus

MIR 2304

Pierce IP裂解缓冲液

Thermo Scientific

87787

Anti-DYKDDDDK磁珠琼脂糖

Thermo Scientific

A36797

NuPage LDS上样缓冲液

Invitrogen

NP0007

报告细胞系构建

MiniPrep试剂盒

Invitrogen

K210011

OptiMEM培养基

Gibco

31985070

体外谷胱甘肽化

还原型谷胱甘肽

Sigma

G4251

环节	核对要点
多重IP-MS筛选	E3连接酶种类及浓度、化合物池浓度、细胞裂解液来源及用量、孵育时间与温度、洗涤条件阅读提示：Methods 'Multiplexed immunoprecipitation and sample preparation for mass spectrometry analysis'及Fig. 1图注
M12诱导DDX18降解的细胞实验	细胞系（Jurkat、Molt4、K562-Cas9）、M12浓度范围（1-20 μM）、处理时间（6-18 h）、抑制剂预处理浓度及时间阅读提示：Fig. 2图注及Extended Data Fig. 2图注、Methods相关章节
CRISPR筛选	sgRNA文库、细胞系、M12浓度（10 μM）、处理时间（18 h）、分选门控策略、重复数阅读提示：Methods 'Genome-scale or UPS-targeted DDX18 reporter CRISPR screen'及Extended Data Fig. 2f-i
cryo-EM样品制备与数据收集	蛋白复合物组成及浓度、M12浓度（10 μM）、去垢剂、冷冻条件、电镜参数、数据收集与处理流程阅读提示：Methods 'Cryo-EM sample preparation and data processing'及Extended Data Table 1
TR-FRET结合实验	蛋白浓度（DCAF11 50-200 nM，DDX18 200-300 nM）、缓冲液组成、GSH/GST浓度、孵育时间、检测参数阅读提示：Methods 'TR-FRET'及对应图注

环节

核对要点

多重IP-MS筛选

E3连接酶种类及浓度、化合物池浓度、细胞裂解液来源及用量、孵育时间与温度、洗涤条件

阅读提示：Methods 'Multiplexed immunoprecipitation and sample preparation for mass spectrometry analysis'及Fig. 1图注

M12诱导DDX18降解的细胞实验

细胞系（Jurkat、Molt4、K562-Cas9）、M12浓度范围（1-20 μM）、处理时间（6-18 h）、抑制剂预处理浓度及时间

阅读提示：Fig. 2图注及Extended Data Fig. 2图注、Methods相关章节

CRISPR筛选

sgRNA文库、细胞系、M12浓度（10 μM）、处理时间（18 h）、分选门控策略、重复数

阅读提示：Methods 'Genome-scale or UPS-targeted DDX18 reporter CRISPR screen'及Extended Data Fig. 2f-i

cryo-EM样品制备与数据收集

蛋白复合物组成及浓度、M12浓度（10 μM）、去垢剂、冷冻条件、电镜参数、数据收集与处理流程

阅读提示：Methods 'Cryo-EM sample preparation and data processing'及Extended Data Table 1

TR-FRET结合实验

蛋白浓度（DCAF11 50-200 nM，DDX18 200-300 nM）、缓冲液组成、GSH/GST浓度、孵育时间、检测参数

阅读提示：Methods 'TR-FRET'及对应图注

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