计算设计与文库构建
生成靶向GPCR不同表位的微型蛋白候选序列。
使用RFdiffusion、motif-guided RFdiffusion、迭代部分扩散和MetaGen（AlphaFold结构宏蛋白质组支架结合Rosetta RifDock）进行设计，ProteinMPNN进行序列设计，AF2 initial guess和Rosetta指标过滤。
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靶向GPCR的微型蛋白从头设计
De novo design of miniproteins targeting GPCRs.
实验完整度
高含计算设计、OPS-RD/酵母展示筛选、体外药理、冷冻电镜结构及小鼠体内药理学多层级验证。
主要模型
MRGPRX1、NK1R、CXCR4、CCR5、OXTR等GPCR设计靶点 CHO-K1、HEK293T、COS-7等哺乳动物细胞系 酵母表面展示文库 CD46转基因小鼠与C57BL/6小鼠
重点核对
OPS-RD筛选以GFP-GPCR与mCherry结合子的像素互相关评分，并按条形码聚类排序 酵母展示以SC50估计和SPR测定结合亲和力，OPS-RD与SPR验证命中的ROC AUC=0.92 钙流、cAMP、β-arrestin招募、G蛋白解离等体外功能实验测定EC50/IC50和pA2 冷冻电镜结构解析mM1_068/mM1_060-MRGPRX1、dCX1_001-CXCR4、dC2_049/dC2_050-CGRPR CD46转基因小鼠皮下给药5 mg/kg，比较dCX1_001与AMD3100的HSPC动员及不良反应
摘要
G蛋白偶联受体（GPCR）在生理过程中具有关键作用，是药物发现和开发的核心靶点，但由于GPCR是整合膜蛋白且构象动态变化，蛋白质激动剂和拮抗剂的设计一直具有挑战性。本文描述了从头设计方法以及一种基于高通量“受体转移”显微筛选的方法，用于生成具有高亲和力、效力和选择性的GPCR结合微型蛋白。我们设计了可激活瘙痒和疼痛相关受体的微型蛋白激动剂，以及抑制与癌症、糖尿病和肥胖等代谢性疾病以及偏头痛相关受体的拮抗剂。五种受体结合设计的冷冻电镜（cryo-EM）结构与计算设计模型接近。一种设计的趋化因子受体拮抗剂在体内动员造血干和祖细胞，水平与临床使用药物相当，且不良反应更少。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过从头计算设计和高通量筛选获得靶向GPCR的微型蛋白激动剂和拮抗剂，并验证其亲和力、效力、选择性和体内功能。
- 核心机制
- 设计的微型蛋白结合GPCR正构口袋或胞外域，通过空间占据和特定界面相互作用激活或阻断受体信号。
- 主要证据
- 针对11种GPCR设计微型蛋白，经OPS-RD和酵母展示筛选，钙流/cAMP/β-arrestin等实验验证功能，五种受体结合复合物的冷冻电镜结构与设计模型接近，dCX1_001在小鼠中动员HSPC。
- 研究意义
- 研究表明从头设计可作为工程化GPCR靶向微型蛋白拮抗剂和激动剂的可行策略，并为功能生物制剂、药理学工具和结构研究提供候选分子。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
高通量结合筛选
从设计文库中鉴定与目标GPCR结合的微型蛋白。
采用OPS-RD（受体转移光学混合筛选）和酵母表面展示（含生物素化ECD、纳米盘或去垢剂稳定受体、哺乳动物细胞展示的biofloating）筛选设计文库。
体外功能验证
验证候选微型蛋白的激动或拮抗活性、效力和选择性。
使用钙动员、cAMP、β-arrestin-1/2招募、G蛋白解离、IP1积累等实验测定EC50、IC50、pA2和Emax，并用PRESTO-Tango进行318种GPCR选择性分析。
结构验证
确认设计模型与受体结合的实际结构及结合模式。
解析mM1_068/mM1_060-MRGPRX1、dCX1_001-CXCR4、dC2_049/dC2_050-CGRPR冷冻电镜结构，并与计算模型比对。
体内药理学验证
评估dCX1_001动员HSPC的体内效果和耐受性。
在CD46转基因小鼠中皮下注射dCX1_001或AMD3100，检测LSK细胞、CFU、GFP+细胞、载体拷贝数和血细胞计数。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Ham's F-12K（Kaighn's）培养基 | Gibco | -- |
| Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM） | Thermo Fisher | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10100147 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| G418 | Gibco | 10131027 | |
| 潮霉素B | Invitrogen | 10687010 | |
| 蛋白表达纯化 | Ni-NTA琼脂糖树脂 | -- | -- |
| Superdex75 Increase 5/150 GL色谱柱 | Cytiva | 29148722 | |
| Superdex S75 10/300 GL色谱柱 | Cytiva | 29148721 | |
| 圆二色光谱 | JASCO J-1500圆二色光谱仪 | JASCO | -- |
| 酵母展示 | FITC偶联抗c-Myc抗体 | Immunology Consultants Laboratory | CMYC-45F |
| PE偶联抗FLAG抗体 | BioLegend | 637310 | |
| 链霉亲和素-藻红蛋白 | Thermo Fisher Scientific | S866 | |
| Alexa Fluor 647偶联抗c-Myc抗体 | BioLegend | 626810 | |
| 链霉亲和素-Alexa Fluor 488偶联物 | Thermo Fisher Scientific | S32354 | |
| 细胞标记与分选 | CellTrace Violet染料 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-生物素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| LS磁柱 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 流式分析 | CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| 流式分选 | SONY SH800细胞分选仪 | SONY | -- |
| 光学混合筛选 | NEBridge Golden Gate组装试剂盒（BsmBI-v2） | New England Biolabs | E1602L |
| KAPA HiFi HotStart预混液 | Roche | KK2601 | |
| Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒 | Zymo | D4007 | |
| Qubit Broad Range +dsDNA定量试剂 | Thermo Fisher Scientific | Q32853 | |
| DNA Clean and Concentrator-5试剂盒 | Zymo | D4014 | |
| Endura感受态细胞 | Biosearch Technologies | 60242–2 | |
| Gene Pulser Xcell电穿孔仪 | Biorad | 1652662 | |
| 6孔玻璃底板 | Cellvis | P06–1.5H-N | |
| cAMP检测 | cAMP Gs HTRF试剂盒 | Cisbio | -- |
| GloSensor F22质粒 | Promega | E2301 | |
| D-荧光素 | GoldBio | LUCNA-1G | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | -- | |
| 荧光素酶检测 | Steady-Glo试剂盒 | Promega | E2520 |
| Bio-Glo荧光素酶检测液 | Promega | G7941 | |
| β-arrestin检测 | PathHunter检测混合液 | DiscoverX | 93–0001 |
| 人PTH | DiscoverX | 4011474 | |
| G蛋白解离检测 | 腔肠素-h | -- | -- |
| 腔肠素-400a | -- | -- | |
| 腔肠素 | GoldBio | CZ05 | |
| TransIT-2020转染试剂 | Mirus | -- | |
| 细胞培养 | 聚乙烯亚胺（PEI Max，分子量40,000） | Polysciences | -- |
| 表面表达检测 | HRP偶联抗FLAG M2抗体 | Sigma-Aldrich | A8592 |
| Janus Green B染液 | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| SPR | 人抗体捕获试剂盒 | Cytiva | BR100839 |
| Series S CM5传感芯片 | Cytiva | -- | |
| 生物素捕获试剂盒 | Cytiva | 28920234 | |
| HBS-EP+缓冲液 | Cytiva | BR100669 | |
| 动物实验 | AMD3100 | Millipore Sigma | 239820 |
| 地塞米松磷酸钠 | Fresenius Kabi | -- | |
| 集落形成实验 | MethoCult GF M3434培养基 | STEMCELL Technologies | 03434 |
| 流式分析 | 生物素偶联谱系（Lin）抗体混合物 | Miltenyi Biotec | 130–092-613 |
| 链霉亲和素偶联APC | Thermo Fisher Scientific | S868 | |
| BV711偶联抗KIT抗体 | BioLegend | 105835 | |
| PE-Cy7偶联抗SCA1抗体 | Thermo Fisher Scientific | 25–5981-82 | |
| BV421偶联抗CD45抗体 | Thermo Fisher Scientific | 404–0451-82 | |
| APC偶联抗CD3抗体 | BioLegend | 100236 | |
| PE-Cy7偶联CD19抗体 | Thermo Fisher Scientific | 25–0193-82 | |
| BV711偶联Gr-1抗体 | BioLegend | 108443 | |
| 载体拷贝数分析 | Purelink基因组DNA分离试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K18200 |
| Power SYBR Green PCR预混液 | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | |
| 细胞因子检测 | BD细胞因子微球阵列小鼠炎症试剂盒 | BD Biosciences | 23–12720 |
| 病毒包装 | pPACKH1 HIV慢病毒包装试剂盒 | System Bioscience | -- |
| 转染 | GeneJuice转染试剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | -- | |
| PCR | Kapa HiFi聚合酶 | Kapa Biosystems | -- |
| DNA纯化 | QIAquick试剂盒 | Qiagen | -- |
| 定点突变 | Quikchange定点突变试剂盒 | New England Biolabs | E0554S |
| cAMP检测 | 佛司可林 | -- | -- |
| 钙动员检测 | 丙磺舒 | -- | -- |
| 功能检测 | P物质 | Tocris | 1156 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| OPS-RD受体转移筛选 | 感染复数（MOI 5–10%）、每结合子成像细胞数（至少80个）、生物学重复数（3次） 阅读提示：Methods“Optical screen”与Fig. 1c,d,e图注 |
| 酵母表面展示 | 首轮靶标浓度1 μM、后续10 pM–1 μM、分选轮次及SC50计算方法 阅读提示：Methods“Yeast display”与“Yeast SC50 estimation from FACS and NGS” |
| 体外功能实验 | 各受体激动剂/拮抗剂浓度范围、预孵育时间、EC50/IC50/pA2及生物学重复数 阅读提示：Methods“In vitro GPCR pharmacology”与Fig. 2、3、4图注 |
| 冷冻电镜结构解析 | 复合物组装比例、去垢剂、数据采集电压/曝光剂量及FSC 0.143分辨率 阅读提示：Methods结构部分与Extended Data Tables 1–3 |
| 小鼠HSPC动员实验 | dCX1_001与AMD3100剂量均为5 mg/kg、皮下给药、每组n=5、采样时间点30 min/60 min/72 h 阅读提示：Fig. 5图注与Methods“HSPCs mobilization in mouse” |
| 药代动力学研究 | 单次静脉给药3 mg/kg、剂量体积5 mL/kg、每组8只C57BL/6小鼠、8个采血时间点 阅读提示：Methods“Study design”与“Dosing and sample collection” |