建立D-JH-RC区域突变细胞系
在生理染色体背景下研究D-RSS方向对D到JH连接的影响。
利用CRISPR/Cas9在v-Abl pro-B细胞系中删除129/Sv等位基因的D-JH-RC区域，保留C57BL/6等位基因，获得DH-JH+/−亲本细胞系，并进一步生成多种D-RSS倒位、JH缺失等突变衍生物。
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染色质环挤出在生理性V(D)J重排中的基础性作用
The fundamental role of chromatin loop extrusion in physiological V(D)J recombination.
实验完整度
高包含v-Abl pro-B细胞系、多种基因突变细胞系及dCas9结合细胞系，结合HTGTS V(D)J-seq、GRO-Seq、ChIP-Seq、3C-HTGTS、Hi-C等多层验证，进行功能与机制验证。
主要模型
v-Abl转化的RAG2缺陷pro-B细胞系（DH-JH+/−及其突变衍生物） JH缺失的v-Abl pro-B细胞系（JHΔ）及其dCas9表达衍生物 DFL16.1JH4倒位细胞系及其3'CBEs−/−、Rag2−/−衍生物
重点核对
DH-JH+/−细胞系中DFL16.1-RSS-DN或-RSS-UP倒位后的D到JH连接类型（缺失性vs倒位性）及频率 JHΔ细胞系中DQ52-RSS-UP和DQ52-RSS-DN启动的RAG隐蔽扫描活性的方向及靶点 dCas9结合Sγ1对下游RAG扫描活性及RC相互作用频率的影响 Iγ2b启动子缺失对Sγ2b转录、RAG扫描活性、RC相互作用及RAD21积累的影响 HTGTS V(D)J-seq分析的重复数（至少3次生物学重复）及统计方法（双尾配对t检验）
摘要
RAG核酸内切酶在祖B细胞（pro-B细胞）中启动IgH位点（Igh）的V(D)J组装，先将D与JH连接，再将上游VH与DJH中间体连接。在小鼠pro-B细胞中，位于Igh 3'端的CTCF结合元件（CBE）锚定的染色质环结构域包含一个内部亚结构域，跨越5'CBE锚点（IGCR1）、DH簇和一个结合RAG的重组中心（RC）。RC包含JH近端的D（DQ52）、4个JH和内含子增强子（iEμ）。强烈的RAG切割仅限于由互补重组信号序列（12RSS和23RSS）侧翼配对的V(D)J片段。D片段下游和上游分别由12RSS侧翼，这些12RSS分别介导与方向相反的JH-23RSS和VH-23RSS的缺失性连接。尽管12/23兼容，通过上游D-12RSS的倒位性D到JH连接却很少见。基于质粒的试验将倒位性D到JH连接的缺乏归因于对下游D-12RSS的序列偏好，而非推定的线性扫描机制。鉴于最近发现RAG线性扫描方向相反的CBE锚定染色质环（可能由黏连蛋白介导的环挤出形成），我们重新审视了扫描的作用。在此，我们报告JH-23RSS的染色体方向编程RC结合的RAG线性扫描3'Igh亚结构域中的上游染色质以寻找方向相反的D-12RSS，从而介导所有D的缺失性连接，除了基于RC的DQ52，其通过扩散相关机制连接。在缺乏JH时形成的基于DQ52的RC中，被下游DQ52-RSS结合的RAG扫描下游含恒定区外显子的3'Igh亚结构域，其中扫描可被靶向的核酸酶失活Cas9（dCas9）结合、通过重复Igh开关序列的转录以及3'Igh CBE基环锚点所阻碍。值得注意的是，每种扫描障碍都会局灶性增加被阻碍区域内潜在底物序列上的RAG活性。RC染色质相互作用的高分辨率映射揭示，这种局灶性RAG靶向与驱动染色质通过RC结合的RAG的环挤出过程相应障碍相关。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RAG如何在线性扫描机制下实现生理性D到JH重排的缺失性偏向，以及染色质环挤出障碍如何影响RAG靶向？
- 核心机制
- JH-23RSS的染色体方向编程RC结合的RAG线性扫描上游或下游染色质，优先识别方向相反的D-12RSS以介导缺失性连接；环挤出障碍（CBE锚点、转录、dCas9结合）局灶性阻碍扫描并增加RAG活性。
- 主要证据
- 利用HTGTS V(D)J-seq分析多种基因突变v-Abl pro-B细胞系中D-RSS方向对连接类型的影响，结合GRO-Seq、ChIP-Seq、3C-HTGTS和Hi-C揭示扫描障碍与环挤出障碍及RC相互作用的关联。
- 研究意义
- 提出环挤出介导的RAG扫描在启动生理性D到JH连接中的关键作用，并提示染色质基础上的机制可能普遍增强功能性顺式元件的突触形成。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RAG2互补及G1期阻滞诱导V(D)J重排
激活V(D)J重组并富集G1期细胞以检测D到JH连接。
通过逆转录病毒感染将RAG2导入RAG2缺陷细胞，用v-Abl激酶抑制剂STI-571处理诱导G1期阻滞和RAG2稳定化。
HTGTS V(D)J-seq分析D到JH连接
定量分析D-RSS-DN与D-RSS-UP在D到JH连接中的利用频率及连接类型。
提取基因组DNA，超声打断，线性PCR扩增，连接桥接适配器，嵌套PCR扩增，Illumina测序，比对到mm9或修饰基因组，计数连接事件。
构建JHΔ细胞系分析DQ52-RSS扫描方向
在缺乏JH的背景下表征DQ52-RSS-UP和DQ52-RSS-DN启动的RAG扫描方向及靶点。
从DH-JH+/−细胞系删除所有JH生成JHΔ细胞系，用DQ52-RSS-UP和DQ52-RSS-DN诱饵引物进行HTGTS V(D)J-seq，分析RAG隐蔽扫描活性。
dCas9靶向Sγ1阻碍RAG扫描
测试dCas9结合作为非CBE基扫描障碍对RAG扫描和染色质环的影响。
在JHΔ细胞系中稳定表达dCas9，并引入靶向Sγ1的sgRNA（16个结合位点），用HTGTS V(D)J-seq、GRO-Seq、3C-HTGTS、Hi-C和ChIP-Seq分析扫描活性、转录、RC相互作用及黏连蛋白分布。
缺失Iγ2b启动子测试转录对RAG扫描的影响
验证Sγ2b转录是否为RAG扫描障碍并影响RC相互作用。
在JHΔ-dCas9细胞系中删除Iγ2b启动子，用GRO-Seq、HTGTS V(D)J-seq、3C-HTGTS和ChIP-Seq分析Sγ2b转录、RAG扫描活性、RC相互作用和RAD21积累。
高分辨率映射RC染色质相互作用
揭示扫描障碍与环挤出障碍及RC相互作用的关联。
使用3C-HTGTS（iEμ诱饵）和Hi-C分析RC与3'Igh结构域内区域的相互作用频率，以及dCas9或转录障碍对相互作用的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| dCas9细胞系构建 | pMSCV-dCas9载体 | Addgene | 44246 |
| 遗传霉素 | Life technologies | 11811-031 | |
| Cas9抗体 | Diagenode | C15310258 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700S | |
| Sγ1-sgRNA表达载体 | Addgene | 44248 | |
| Zeocin | ThermoFisher Scientific | R25001 | |
| RAG2互补 | pMSCV-puro载体 | Addgene | K1062-1 |
| HTGTS V(D)J-seq | Dynabeads MyONE C1链霉亲和素磁珠 | Life Technologies | 65002 |
| Mi-Seq测序仪 | Illumina | -- | |
| GRO-Seq | BrdU抗体偶联磁珠 | Santa Cruz biotechnology | sc-32323-ac |
| RppH | NEB | M0356S | |
| T4多核苷酸激酶 | NEB | M0201S | |
| Next-Seq 550测序仪 | Illumina | -- | |
| Hi-Seq 2500测序仪 | Illumina | -- | |
| ChIP-Seq | RAD21抗体 | Abcam | ab992 |
| NIPBL抗体 | Bethyl Laboratories | A301-779A | |
| Illumina Truseq ChIP样本制备试剂盒 | Illumina | IP-202-1012 | |
| 3C-HTGTS | DpnII | NEB | R0543L |
| NlaIII | NEB | R0125L | |
| T4 DNA连接酶 | NEB | M0202L |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系构建与验证 | DH-JH+/−细胞系的遗传背景（C57BL/6, 129/Sv混合）、删除区域边界（DFL16.1上游约400 bp至iEμ下游约400 bp）、验证方法（Southern blotting） 阅读提示：Methods 'Generation of mutant v-Abl pro-B cell lines'及Extended Data Fig. 2a-c |
| RAG2互补与G1期阻滞 | RAG2表达载体（pMSCV-FLAG-RAG2-GFP）、嘌呤霉素筛选时间（3天）、STI-571浓度（3 mM用于HTGTS，3 μM用于GRO-Seq）及处理时间（4天） 阅读提示：Methods 'RAG complementation'及'HTGTS V(D)J-seq library preparation' |
| HTGTS V(D)J-seq | DNA起始量（10 μg）、诱饵引物（JH1 CE或DQ52-RSS引物）、标准化方法（总连接数或特定连接数）、重复数（至少3个生物学重复文库） 阅读提示：Methods 'HTGTS V(D)J-seq library preparation'及'HTGTS V(D)J-seq analysis of deletional and inversional D to JH recombination' |
| dCas9靶向Sγ1 | dCas9和sgRNA表达载体（Addgene 44246和44248）、筛选药物浓度（遗传霉素1,600 μg/ml初始，400 μg/ml维持；Zeocin 800 μg/ml初始，400 μg/ml维持）、验证方法（Western blotting、RT-PCR） 阅读提示：Methods 'Generation of v-Abl lines with targeted dCas9-binding to Sγ1 region'及Extended Data Fig. 7b, c |
| 3C-HTGTS | 交联条件（2%甲醛室温10分钟）、限制酶（DpnII或NlaIII，700 units）、消化时间（过夜）、连接条件（T4 DNA ligase 100 units，稀释条件）、重复数（DpnII 4个生物学重复，NlaIII 3个生物学重复） 阅读提示：Methods '3C-HTGTS library preparation and analysis'及Figure 3f、4d图注 |
| Hi-C | 限制酶（MboI）、交联细胞数（约100万）、测序深度（对照2.3B read pairs，障碍2.2B read pairs）、分析流程（Juicer） 阅读提示：Methods 'Hi-C analysis'及Extended Data Fig. 8a |
| GRO-Seq | STI-571浓度（3 μM）、处理时间（4天）、核连缀反应条件（37°C 5分钟，BrdU标记）、测序平台（Next-Seq 550或Hi-Seq 2500） 阅读提示：Methods 'GRO-Seq library preparation and analysis' |
| ChIP-Seq | 抗体用量（RAD21 5 μg，NIPBL 5 μg）、细胞数（2000万）、交联条件（1%甲醛室温10分钟）、超声条件（平均200-300 bp）、重复数（2个生物学重复） 阅读提示：Methods 'ChIP-Seq library preparation and analysis'及Extended Data Fig. 8c, d |
| 统计分析 | 统计方法（双尾配对t检验）、显著性阈值（P < 0.05）、样本量（未预先确定） 阅读提示：Methods 'Statistical analysis' |