重组YTHDF蛋白的体外相分离表征
验证YTHDF蛋白是否能在体外发生液-液相分离及其基本理化性质。
纯化全长重组DF1、DF2、DF3，通过升温、盐浓度、甘油浓度、荧光标记、FRAP和结构域缺失实验检测液滴形成及液体性质。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
m6A增强mRNA的相分离潜能
m6A enhances the phase separation potential of mRNA.
实验完整度
高包含体外重组蛋白相分离、细胞应激颗粒定位、Mettl14敲除、smFISH、RNA-seq和核糖体图谱等多个独立证据层级及功能验证
主要模型
重组YTHDF1-3蛋白体外相分离体系 小鼠胚胎干细胞（mES，野生型与Mettl14敲除） HEK293T、U2OS、NIH3T3细胞系 小鼠脑提取物异噁唑诱导的神经元RNA颗粒
重点核对
重组DF2蛋白浓度75 μM，缓冲液含20 mM HEPES pH 7.4、300 mM KCl、6 mM MgCl2、0.02% NP-40，温度从4°C升至37°C诱导相分离 含10个m6A的65-nt RNA（570 nM）诱导DF2（25 μM）相分离，而含0或1个m6A的RNA不诱导 热休克42°C 30 min或亚砷酸钠0.5 mM处理30–60 min诱导应激颗粒，DF2与TIAR共定位 Mettl14敲除mES细胞中DF2向应激颗粒和P小体的定位显著减少 应激颗粒mRNA中m6A水平比总细胞mRNA高约45%–50%，且m6A位点数与应激颗粒富集程度相关
摘要
N6-甲基腺苷（m6A）是mRNA中最常见的修饰核苷酸，约25%的mRNA含有至少一个m6A。mRNA甲基化形成m6A是多种细胞和生理过程所必需的。尽管mRNA中m6A的存在可以以不同方式影响其命运，但m6A如何指导这一过程以及为什么m6A的效果在不同细胞环境中可能不同尚不清楚。在这里，我们显示胞质m6A结合蛋白YTHDF1–3在体外和细胞中经历液-液相分离（LLPS）。这种LLPS被含有多个（而非单个）m6A残基的mRNA显著增强。多甲基化mRNA作为结合YTHDF蛋白的多价支架，使它们的低复杂度结构域并置，导致相分离。由此产生的mRNA-YTHDF复合物随后分配到不同的内源性相分离区室中，例如P小体、应激颗粒或神经元RNA颗粒。m6A-mRNA受到区室特异性调控，包括降低的mRNA稳定性和翻译。这些研究揭示，细胞mRNA中m6A位点的数量和分布可以调节和影响相分离转录组的组成。此外，这些发现表明m6A修饰mRNA的细胞特性受液-液相分离原理支配。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- m6A如何指导mRNA命运，以及为什么m6A的效果在不同细胞环境中可能不同。
- 核心机制
- 多甲基化m6A mRNA作为多价支架结合多个YTHDF蛋白，使其低复杂度结构域并置，促进液-液相分离，形成的mRNA-YTHDF复合物分配到P小体、应激颗粒或神经元RNA颗粒等相分离区室中。
- 主要证据
- 重组YTHDF蛋白体外相分离实验、细胞应激颗粒定位与FRAP、Mettl14敲除细胞、smFISH、应激颗粒转录组分析、RNA-seq和核糖体图谱。
- 研究意义
- 揭示m6A位点的数量和分布可调节相分离转录组的组成，m6A修饰mRNA的细胞特性受液-液相分离原理支配。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
m6A-RNA对YTHDF蛋白相分离的增强作用
验证多甲基化m6A RNA是否作为支架促进YTHDF蛋白相分离。
在不相分离的缓冲液和蛋白浓度下，加入含0、1或10个m6A的65-nt RNA，观察DF2液滴形成并计算分配系数。
细胞应激条件下YTHDF蛋白向应激颗粒的定位
验证YTHDF蛋白是否在细胞中相分离并定位到应激颗粒。
用热休克、亚砷酸钠或ER应激处理多种细胞，免疫染色检测DF1-3与应激颗粒标志物TIAR的共定位，并用CRISPR/Cas9敲入DF2-NeonGreen进行FRAP。
m6A-mRNA对YTHDF蛋白区室定位的必要性
验证YTHDF蛋白向应激颗粒和P小体定位是否依赖m6A-mRNA。
在Mettl14敲除mES细胞中检测DF2向应激颗粒和P小体的定位，并用m6A结合缺陷型DF2 W432A突变体在野生型细胞中验证。
应激颗粒中m6A-mRNA的富集分析
验证多甲基化mRNA是否优先富集于应激颗粒等相分离区室。
纯化应激颗粒mRNA并用TLC检测m6A水平，利用已发表的应激颗粒转录组和m6A图谱分析m6A位点数与富集程度的关系，并用smFISH验证。
m6A-mRNA在相分离区室中的命运分析
验证相分离区室分配是否影响m6A-mRNA的稳定性和翻译效率。
在热休克前后及恢复期进行RNA-seq和核糖体图谱分析，比较野生型与Mettl14敲除mES细胞中m6A修饰对mRNA丰度和翻译效率的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | ThermoFisher Scientific | 11995–065 |
| Knockout DMEM培养基 | Invitrogen | 10829018 | |
| 小鼠白血病抑制因子 | EMD Millipore | ESG1107 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004-02 | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006-02 | |
| 免疫染色 | Hoechst 33342 | Life Technologies | 66249 |
| Prolong Diamond抗淬灭封片剂 | Life Technologies | P36961 | |
| 蛋白纯化 | 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 05892791001 |
| Talon金属亲和树脂 | Clontech | -- | |
| 蛋白标记 | Alexa Fluor 488微量蛋白标记试剂盒 | Thermo Fischer Scientific | A30006 |
| Alexa Fluor 594微量蛋白标记试剂盒 | Thermo Fischer Scientific | A30008 | |
| Alexa Fluor 647微量蛋白标记试剂盒 | Thermo Fischer Scientific | A30009 | |
| 体外转录 | AmpliScribe T7高产转录试剂盒 | Lucigen | AS3107 |
| N6-甲基腺苷5’三磷酸 | TriLink | -- | |
| BODIPY FL-鸟苷5’-O-(3-硫代三磷酸) | Invitrogen | G22183 | |
| RNA纯化 | 寡核苷酸清洁浓缩柱 | Zymo Research | D4061 |
| RNA检测 | SYBR Gold核酸染料 | -- | S11494 |
| TLC分析 | RNase T1 | ThermoFisher Scientific | -- |
| T4多核苷酸激酶 | NEB | -- | |
| 腺苷三磷酸双磷酸酶 | NEB | -- | |
| P1核酸酶 | Sigma | -- | |
| PEI-纤维素板 | MerckMillipore | -- | |
| smFISH | ViewRNA Cell Plus检测试剂盒 | Invitrogen | 88–19000 |
| Western blot | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 |
| 4–12% Bis–Tris凝胶 | Invitrogen | -- | |
| ChemiDoc XRS+成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫荧光 | 兔抗TIAR抗体 | Cell Signaling Technology | 5137S |
| 鼠抗Edc4（H-12）抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-376382 | |
| 兔抗YTHDF2抗体 | Proteintech | 24744–1-AP | |
| 兔抗YTHDF1抗体 | Proteintech | 17479-AP | |
| 兔抗YTHDF3抗体 | Abcam | ab103328 | |
| 鼠抗嘌呤霉素克隆12D10抗体 | Millipore Sigma | MABE343 | |
| 兔抗IgG Alexa Fluor 594二抗 | Invitrogen | A11012 | |
| 鼠抗IgG Alexa Fluor 488二抗 | Invitrogen | A11001 | |
| Western blot | 兔抗YTHDF2抗体 | Aviva System Biology | ARP67917_P050 |
| 鼠抗GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-365062 | |
| 转染 | Fugene HD转染试剂 | Promega | E2311 |
| RNA-seq | NEBNext Ultra定向RNA文库构建试剂盒 | NEB | -- |
| NEBNext rRNA去除试剂盒 | NEB | -- | |
| 核糖体图谱 | Ribo-Zero Gold rRNA去除试剂 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外YTHDF蛋白相分离 | DF2蛋白浓度75 μM；缓冲液组成（20 mM HEPES pH 7.4, 300 mM KCl, 6 mM MgCl2, 0.02% NP-40）；温度从4°C升至37°C；降温可逆性 阅读提示：Methods中Droplet formation小节及Fig. 1a–c图注 |
| m6A-RNA诱导相分离 | DF2浓度25 μM；RNA浓度570 nM；缓冲液含10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0.01% NP-40, 10%甘油；37°C孵育10 min；RNA中m6A数量（0、1或10个） 阅读提示：Methods中Droplet formation和In vitro transcription小节及Fig. 1f–g图注 |
| 细胞应激颗粒诱导与DF2定位 | 热休克42°C 30 min；亚砷酸钠0.5 mM处理30–60 min；毒胡萝卜素浓度和时间；细胞类型（mES、HEK293、U2OS、NIH3T3）；抗体稀释比例 阅读提示：Methods中Cell culture和Immunostaining小节及Fig. 2、Extended Data Fig. 2图注 |
| Mettl14敲除细胞验证 | Mettl14敲除mES细胞来源；热休克或亚砷酸钠处理条件；DF2荧光强度比值计算方式；样本量（WT n=35，KO n=32个应激颗粒） 阅读提示：Methods中Cell culture小节、Fig. 3a–b图注及Extended Data Fig. 3a |
| 核糖体图谱与翻译效率分析 | 热休克42°C 30 min后恢复37°C 1 h；RNA-seq和核糖体图谱生物学重复数（WT 4个，KO 2–3个）；m6A位点注释来源；翻译效率计算工具xtail 阅读提示：Methods中Ribosome profiling和RNA-seq analysis小节及Fig. 4f–g图注 |