全激酶组筛选鉴定MEK1/2诱导BRAF-KSR1二聚化
筛选能诱导BRAF-KSR1激酶域二聚化的因子
使用BRET生物传感器（RlucII-BRAFKD-CAAX和GFP10-KSR1KD-CAAX）筛选558种人激酶ORF，鉴定MEK1/2为特异性诱导剂。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
MEK通过变构控制KSR蛋白驱动BRAF激活
MEK drives BRAF activation through allosteric control of KSR proteins.
实验完整度
高结合BRET、co-IP、Y2H、NMR、晶体结构、SEC-MALS及功能验证，多层级证据支持机制。
主要模型
HEK293T细胞 HeLa细胞 果蝇S2细胞 酵母双杂交系统
重点核对
MEK1与KSR1的结合依赖性：MEK1 F311S突变或KSR1 W831R突变破坏结合 BRAF-KSR1二聚化依赖MEK1及激酶域侧面二聚化界面（BRAF R509H或KSR1 R665H突变破坏） MEK1诱导的BRAF反式激活需要KSR1-MEK结合及BRAF-KSR1二聚化 BRS-CC-SAM相互作用的关键残基（如BRAF M53D、KSR1 L47D/C62D、E72K/K88E）影响结合和功能 MEK1结合KSR1释放其NTR与激酶域的自抑制相互作用
摘要
RAF家族激酶在癌症中扮演重要角色。其激活依赖于激酶域的二聚化，这已成为药物开发的障碍。在哺乳动物中，RAF家族激酶包括三种具有催化能力的酶（A、B和CRAF）和两种假激酶（KSR1/2），后者因其明显的桥接RAF异构体和底物MEK的能力而被描述为支架。KSR假激酶也被证明与具有激酶活性的RAF二聚化以变构刺激催化。虽然GTP结合的RAS可以通过结合RAF异构体的RAS结合域（RBD）来调节其二聚化，但KSR1/2缺乏RBD，因此它们与其他RAF家族成员二聚化的调控原理仍不清楚。在这里，我们表明BRAF与KSR1的选择性异二聚化是由每种蛋白质的N端调节区（NTR）之间的直接接触所指定，这些接触部分由BRAF中称为BRS的新结构域和KSR1中的CC-SAM结构域组成。我们还发现，MEK结合到KSR1的激酶域不对称地驱动BRAF-KSR1异二聚化，导致BRAF对游离MEK分子的催化活性同时受到刺激。这些发现表明，KSR-MEK复合物通过NTR和激酶域接触的作用变构激活BRAF，并挑战了KSR作为MEK募集到RAF的支架的公认作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- KSR1/2缺乏RBD，其与BRAF选择性二聚化及激活BRAF的分子机制是什么？
- 核心机制
- MEK结合KSR1激酶域αG螺旋，不对称驱动BRAF-KSR1异二聚化；BRAF的BRS域与KSR1的CC-SAM域直接接触介导选择性；KSR-MEK复合物变构激活BRAF，使其磷酸化游离MEK。
- 主要证据
- BRET生物传感器筛选激酶库发现MEK1/2特异性诱导BRAF-KSR1二聚化；co-IP和Y2H验证关键突变；NMR和晶体结构解析BRS-CC-SAM复合物；功能实验表明MEK1结合KSR1促进BRAF反式激活和MEK磷酸化。
- 研究意义
- 挑战KSR作为支架的经典观点，提出KSR为MEK依赖性变构激活剂；揭示RAF家族NTR可作为癌症中选择性调节RAS-ERK信号的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证MEK与KSR1/BRAF的结合及对二聚化的影响
确认MEK1与KSR1、BRAF的直接结合及其对BRAF-KSR1二聚化的必要性
通过Y2H筛选获得MEK1 F311S和KSR1 W831R突变，破坏MEK1与KSR1/BRAF的结合；BRET和co-IP检测这些突变对MEK1诱导的BRAF-KSR1二聚化的影响。
验证MEK1对BRAF-KSR1反式激活的影响
检测MEK1结合KSR1是否促进BRAF对MEK的磷酸化
co-IP检测pMEK水平，使用KSR1 W831R、BRAF I666R、BRAF R509H、KSR1 R665H等突变及KSR1激动突变，评估MEK1对BRAF反式激活的依赖。
鉴定MEK1激活段突变恢复与KSR1W831R的结合
获得能结合KSR1W831R的MEK1突变体，以区分激活型MEK和底物MEK
通过易错PCR和饱和突变Y2H筛选，获得MEK1 M219V、N221Y和M219W-A220L突变，验证其恢复结合并促进BRAF-KSR1W831R二聚化和反式激活。
证明BRAF可磷酸化未结合KSR1的MEK1分子
验证存在两个功能不同的MEK分子：激活型MEK和底物MEK
共表达8GS-MEK1WT（不能结合KSR1W831R）和MEK1M219W-A220L（可结合KSR1W831R），检测8GS-MEK1WT的磷酸化，依赖BRAF和KSR1W831R。
鉴定BRAF NTR中BRS域与KSR1 NTR中CC-SAM域的特异性相互作用
确定介导BRAF-KSR1选择性异二聚化的NTR结构域
通过co-IP、BRET和Y2H检测NTR截短体，发现BRS和CC-SAM域直接相互作用；CRD增强相互作用；BRS插入CRAF增强CRAF-KSR1结合和反式激活。
解析BRS域晶体结构及BRS-CC-SAM复合物结构
从结构层面揭示BRS与CC-SAM的相互作用模式
解析BRS域2.1Å晶体结构（α-发夹）和BRS-CC-SAM融合蛋白1.75Å晶体结构，显示反式四螺旋束接触；NMR验证结合界面；突变验证关键残基。
研究MEK1结合KSR1对其NTR-激酶域自抑制相互作用的释放
解释MEK如何释放KSR1的NTR以促进与BRAF的相互作用
co-IP检测KSR1 NTR与激酶域的相互作用，发现MEK1剂量依赖性破坏该相互作用，而KRASG12V无影响；BRAF NTR-激酶域相互作用则被KRASG12V破坏。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证机制链路
结构解析与生物物理分析
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 转染 | 聚乙烯亚胺 | -- | -- |
| TransIT-LT1转染试剂 | Mirus | -- | |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| BRET实验 | 腔肠素400a | Biotium | -- |
| Hank平衡盐溶液 | Wisent | -- | |
| 白色不透明微孔板 | Greiner | -- | |
| EnVision酶标仪 | PerkinElmer | -- | |
| FlexStation II酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| VICTOR Light酶标仪 | Perkin Elmer | -- | |
| Synergy NEO酶标仪 | BioTek | -- | |
| 细胞活力检测 | WST-1试剂 | -- | -- |
| 免疫共沉淀 | 抗Flag M2抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 |
| Protein A/G琼脂糖珠 | Calbiochem | -- | |
| Western blot | 抗磷酸化MEK抗体 | Cell Signaling Technology | 9121 |
| 抗MEK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9122 | |
| 抗BRAF抗体 | Santa Cruz | sc-9002 | |
| 抗CRAF抗体 | BD-Millipore | 610152 | |
| 抗KSR1抗体 | Abcam | ab68483 | |
| 抗MEK1抗体 | BD-Millipore | 610121 | |
| 抗MEK2抗体 | BD-Millipore | 610235 | |
| 抗GFP抗体 | Santa Cruz | sc-8334 | |
| 抗Ras抗体 | Abcam | ab108602 | |
| 抗HSP90抗体 | New England Biolabs | 4877 | |
| 抗CDC37抗体 | Santa Cruz | sc-13129 | |
| 抗pan-14-3-3抗体 | Cell Signaling Technology | 8312 | |
| 抗V5抗体 | Invitrogen | 46-0705 | |
| 抗Myc抗体(9G10) | -- | -- | |
| 抗HA抗体(12CA5) | -- | -- | |
| 抗小鼠HRP二抗 | Jackson Immunoresearch Labs | 115-035-146 | |
| 抗兔HRP二抗 | Jackson Immunoresearch Labs | 111-035-144 | |
| ATP结合实验 | ActivX ATP探针（脱硫生物素-ATP） | Thermo-Fisher Scientific | -- |
| 链霉亲和素-琼脂糖高性能树脂 | GE healthcare | -- | |
| 蛋白纯化 | 谷胱甘肽亲和树脂 | GE Healthcare | -- |
| Superdex75 24 ml色谱柱 | GE healthcare | -- | |
| 镍亲和色谱 | GE Healthcare | -- | |
| 荧光偏振 | BODIPY-ATP | -- | -- |
| 384孔黑色平底低边板 | Corning | 3573 | |
| 晶体学 | Bis-Tris缓冲液 | -- | -- |
| 硫酸铵 | -- | -- | |
| 甲酸钠 | -- | -- | |
| NMR | 15N-氯化铵 | Cambridge Isotopes | -- |
| 重水 | -- | -- | |
| SEC-MALS | MiniDawn Treos检测器 | Wyatt technologies | -- |
| Optilab T-rEX检测器 | Wyatt technologies | -- | |
| WTC030S5色谱柱 | Wyatt technologies | -- | |
| 质粒构建 | QuickChange II定点突变试剂盒 | Agilent | -- |
| 质粒纯化 | Qiaprep小量质粒提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| 慢病毒载体 | pLX301慢病毒载体 | Addgene | -- |
| pLKO.1-puro载体 | -- | -- | |
| 细胞系 | HEK293T细胞 | Sigma-Aldrich | 12022001-1VL |
| HeLa细胞 | Sigma-Aldrich | 93021013-1VL |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| BRET实验 | 细胞数量（1.5×10^5细胞/孔）、转染试剂PEI浓度（25 μg/ml）、Coelenterazine 400a浓度（2.5 μM）、孵育时间（15分钟）、BRET2滤光片设置 阅读提示：Methods 'BRET experiments'小节 |
| 免疫共沉淀 | 细胞数量（2×10^6细胞）、裂解缓冲液组成、抗体用量（anti-Flag M2 1μl或anti-Pyo 50μl）、孵育时间（4小时或过夜）、洗涤次数（3次） 阅读提示：Methods 'Co-immunoprecipitations and western immunoblotting'小节 |
| 酵母双杂交筛选 | 酵母菌株（PJ69-4a/α）、培养基（SD-Trp, SD-Leu, SD-TLH, SD-TLA）、培养温度（30°C）、突变引入方法（易错PCR）、筛选标记 阅读提示：Methods 'Yeast two-hybrid methods'小节 |
| 蛋白纯化与结构解析 | 表达菌株（BL21-CodonPlus DE3-RIL）、诱导条件（18°C过夜，1 mM IPTG）、纯化步骤（亲和层析、TEV酶切、SEC）、结晶条件（Bis-Tris pH 6.5, 2.0 M硫酸铵等） 阅读提示：Methods 'Protein expression and purification'和'Protein crystallography'小节 |
| NMR实验 | 蛋白质浓度（100-200 μM）、缓冲液组成（50 mM磷酸钠pH 6.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM TCEP, 5% D2O）、温度（20°C）、磁场强度（600或800 MHz） 阅读提示：Methods 'NMR experiments'小节 |