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        Braf激酶失活突变体诱导肺腺癌

        A Braf kinase-inactive mutant induces lung adenocarcinoma.

        作者信息Patricia Nieto, Chiara Ambrogio, Laura Esteban-Burgos, Gonzalo Gómez-López, María Teresa Blasco, Zhan Yao, Richard Marais, Neal Rosen, Roberto Chiarle, David G Pisano, Mariano Barbacid, David Santamaría
        PMID28783725
        期刊Nature
        发布时间2017-08-10
        DOI10.1038/nature23297
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含多种基因工程小鼠模型、细胞系体外验证、人肿瘤数据集分析，并有功能与机制验证。

        主要模型

        Kras+/LSLG12Vgeo;Braf+/LSLD631A (KB) 小鼠 Kras+/LSLG12Vgeo;Braf lox/LSLD631A (KBL) 小鼠 Braf+/LSLD631A 小鼠 Kras+/FSFG12V;Tg.hUb-cre-ERT2+/T;Braf+/LSLD631A (KFB) 小鼠

        重点核对

        Ad-Cre intratracheal infection dose: 10^6 adenoviral particles (unless stated otherwise) Mek inhibitor PD-0325901 daily gavage, dose-dependent effects observed Tamoxifen-containing diet to induce Braf(D631A) expression in KFB mice Survival analysis using Kaplan-Meier and log-rank test Tumour burden quantification as per cent of total lung area

        摘要

        在近一半的人类肺腺癌中，起始致癌事件仍然未知，这一事实使得开发选择性靶向治疗变得复杂。然而，这些肿瘤携带许多无明显致癌功能的改变，包括BRAF失活突变。在肺中，失活BRAF突变体比在其他肿瘤类型中常见的激活型V600E突变体更普遍。在此，我们证明，在小鼠中表达内源性Braf(D631A)激酶失活异构体（对应人类BRAF(D594A)突变）可在体内触发肺腺癌，表明BRAF失活突变是肺肿瘤发生的起始事件。此外，在部分KRAS驱动的人类肺肿瘤中也发现了失活BRAF突变。在小鼠肺细胞中共表达Kras(G12V)和Braf(D631A)可显著增强肿瘤起始，这一现象由Craf激酶活性介导，并且在晚期肺腺癌中激活时可有效加速肿瘤进展。我们还报道了野生型Braf激酶在维持Kras(G12V)/Braf(D631A)驱动肿瘤中的关键作用。野生型Braf等位基因的消融通过诱导MAPK信号进一步增加导致致癌毒性，从而阻止肺腺癌的发展；这种效应可通过药理学抑制Mek来消除，从而恢复肿瘤生长。然而，野生型Braf的缺失也诱导club细胞转分化，导致致命性细支气管内病变的快速发展。这些观察表明，MAPK通路的信号强度不仅是肿瘤发展的关键决定因素，也是决定癌症起始细胞性质以及最终肿瘤表型的关键因素。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        BRAF失活突变是否能在肺中起始腺癌，以及MAPK信号强度如何影响肿瘤发展和细胞起源？
        核心机制
        Braf(D631A)与Craf形成异二聚体，激活Craf激酶，增强MAPK信号；野生型Braf缺失进一步增加MAPK信号导致毒性，或诱导club细胞转分化。
        主要证据
        基因工程小鼠模型显示Braf(D631A)单独或与Kras(G12V)协同诱导肺腺癌；Craf失活突变体减弱肿瘤发生；MEK抑制剂挽救KBL小鼠的毒性表型；谱系特异性Ad-Cre病毒感染证明club细胞转分化。
        研究意义
        提供了BRAF失活突变作为肺腺癌起始事件的遗传学证据，提示MAPK信号强度是肿瘤发展的关键决定因素，并支持选择性CRAF抑制剂可能用于此类患者。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        构建条件性基因工程小鼠模型

        在体内实现不同水平的MAPK信号强度

        将KrasLSLG12Vgeo、Braf LSLD631A、Braf lox等位基因组合，通过Ad-Cre诱导重组，产生K、KB、KBL小鼠。

        2

        评估肿瘤发生与生存

        比较不同MAPK信号强度对肺肿瘤起始和进展的影响

        Ad-Cre感染后，通过X-gal染色、H&E染色、生存分析、肿瘤负荷定量评估K、KB、KBL小鼠的肺病变。

        3

        验证Craf激酶依赖性

        确定Braf(D631A)诱导的肿瘤表型是否由Craf激酶活性介导

        将Craf LSLD468A或Craf lox等位基因引入KB小鼠，产生KBCKD和KBCL小鼠，评估p-Erk1/2水平、肿瘤负荷和生存。

        4

        谱系追踪确定细胞起源

        确定KBL小鼠中细支气管内癌的细胞起源

        使用Ad-SPC-Cre（靶向AT2细胞）和Ad-CC10-Cre（靶向club细胞）感染K、KB、KBL小鼠，2个月后分析肺组织。

        5

        评估Braf(D631A)在已有KrasG12V肿瘤中的作用

        测试Braf(D631A)能否加速已形成的KrasG12V驱动肿瘤的进展

        使用KFB小鼠，先通过Ad-Flp诱导KrasG12V表达形成肿瘤，再通过tamoxifen饮食诱导Braf(D631A)表达，用CT监测肿瘤体积变化。

        6

        测试Braf(D631A)单独诱导肺腺癌的能力

        确定Braf失活突变体是否能在没有Kras突变的情况下起始肺腺癌

        Ad-Cre感染Braf+/LSLD631A小鼠，12个月后分析肺肿瘤发生率和组织学。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        全组织X-gal染色苏木精-伊红染色免疫组织化学计算机断层扫描
        验证分子表达变化
        蛋白质印迹
        验证机制链路
        条件性基因敲除/敲入谱系特异性Ad-Cre感染
        评估体内效果
        Kaplan-Meier生存分析肿瘤负荷定量
        数据分析与统计
        对数秩检验

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        肿瘤诱导表达Cre重组酶的腺病毒University of Iowa Vector Core Facility--
        靶向club细胞的Ad-CreUniversity of Iowa Vector Core Facility--
        靶向AT2细胞的Ad-CreUniversity of Iowa Vector Core Facility--
        表达Flp重组酶的腺病毒University of Iowa Vector Core Facility--
        药物处理Mek抑制剂PD-0325901Tocris Bioscience--
        免疫组化抗SPC抗体MilliporeAB3786
        抗CC10抗体Santa Cruz BiotechnologySC-9772
        抗Ttf1抗体Epitomics2044-1
        抗Sox2抗体Cell Signaling Technology3728
        抗p63抗体Thermo ScientificMS-1081-P
        抗Ck5抗体CovancePRB-160P
        抗磷酸化Erk1/2抗体Cell Signaling Technology9101
        Western blot抗Araf抗体Cell Signaling Technology4432
        抗Braf抗体Santa Cruz BiotechnologySC-5284
        抗Craf抗体BD Biosciences610151
        抗Erk1抗体BD Biosciences554100
        抗Erk2抗体BD Biosciences610103
        抗γ-H2AX抗体Millipore05-636
        抗磷酸化p90Rsk抗体Cell Signaling Technology9341
        抗p90Rsk抗体Santa Cruz BiotechnologySC-231
        抗p53抗体Cell Signaling Technology2524
        抗p19ARF抗体Abcamab80
        抗Cleaved caspase-3抗体Cell Signaling Technology9661
        抗Gapdh抗体SigmaG8795
        细胞培养4-羟基他莫昔芬Sigma--
        组织固定10%缓冲福尔马林Sigma--
        CT扫描GE eXplore Locus微型PET-CT扫描仪GE Healthcare--

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        肿瘤诱导
        小鼠年龄（8-12周）、腺病毒剂量（10^6颗粒，除非另有说明）、麻醉剂剂量（ketamine 75 mg/kg，xylazine 12 mg/kg）
        阅读提示：Methods: Tumour induction and drug treatments
        Mek抑制剂处理
        PD-0325901剂量（文中未明确说明具体剂量，仅说明剂量依赖性）、给药方式（每日灌胃）、溶剂（0.5% hydroxypropyl methyl cellulose, 0.2% Tween-80水溶液）
        阅读提示：Methods: Tumour induction and drug treatments; Figure 1d
        KFB小鼠tamoxifen诱导
        tamoxifen饮食持续时间（8周）、肿瘤体积CT评估时间点
        阅读提示：Figure 4a; Extended Data Figure 5
        谱系追踪实验
        Ad-SPC-Cre和Ad-CC10-Cre的剂量（文中未明确说明，仅说明使用细胞类型限制性病毒）、感染后分析时间（2个月）
        阅读提示：Figure 3d,e; Results
        Braf(D631A)单独诱导肿瘤实验
        Ad-Cre剂量（文中未明确说明，参考Methods中通用剂量10^6颗粒）、观察时间（12个月）
        阅读提示：Results; Figure 4b

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