CAD神经元分化模型建立与ACSS2定位
确定ACSS2在神经元分化过程中的亚细胞定位变化。
CAD细胞血清剥夺分化5天，免疫荧光和Western blot检测ACSS2和ACL的细胞质/核分布。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
乙酰辅酶A合成酶调控组蛋白乙酰化与海马记忆
Acetyl-CoA synthetase regulates histone acetylation and hippocampal memory.
实验完整度
高使用CAD细胞、原代神经元和AAV9小鼠模型，结合RNA-seq、ChIP-seq、Western blot、免疫荧光及行为学功能验证。
主要模型
CAD神经元细胞系 原代小鼠海马和皮层神经元 AAV9介导海马ACSS2敲低的小鼠
重点核对
CAD细胞分化：血清剥夺5天诱导神经元分化，shRNA敲低ACSS2或ACL后RNA-seq ACSS2抑制剂处理：20 μM ACSS2i处理24小时，DMSO对照 海马ACSS2敲低：AAV9.shACSS2注射至背侧海马（AP −2.0mm, DV −1.4mm, ML +/−1.5mm），每组n=10 物体位置记忆测试：训练后24小时测试，记录探索时间和辨别指数 染色质结合：ChIP-seq检测ACSS2与H3K9ac、H4K5ac、H4K12ac共定位
摘要
乙酰辅酶A的代谢产生与组蛋白乙酰化和基因调控相关，但精确机制在很大程度上尚不清楚。在此，我们展示代谢酶乙酰辅酶A合成酶2（ACSS2）是神经元中组蛋白乙酰化的直接调节因子，并且在哺乳动物中调节空间记忆。在神经元细胞培养模型中，ACSS2在分化的神经元细胞核中增加，并定位于组蛋白乙酰化升高的附近上调的神经元基因。ACSS2的减少会降低核乙酰辅酶A水平、组蛋白乙酰化以及一组神经元基因的响应性表达。在成年小鼠中，海马ACSS2表达的减弱会损害长期空间记忆，这是一种依赖组蛋白乙酰化的认知过程。海马中ACSS2的减少还导致被ACSS2预结合的记忆相关神经元基因上调缺陷。这些结果揭示了细胞代谢、基因调控和神经可塑性之间的独特联系，在染色质“现场”产生乙酰辅酶A用于组蛋白乙酰化与关键神经元基因的转录之间建立了联系。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ACSS2是否以及如何通过调节组蛋白乙酰化来调控神经元基因表达和海马依赖的空间记忆？
- 核心机制
- ACSS2结合到神经元基因的染色质上，局部提供乙酰辅酶A以支持组蛋白乙酰转移酶（如CBP）的活性，从而促进组蛋白乙酰化和记忆相关即刻早期基因的转录。
- 主要证据
- 在分化CAD神经元中，ACSS2敲低或抑制降低核乙酰辅酶A和组蛋白乙酰化，并减少神经元基因诱导；ACSS2 ChIP-seq峰与组蛋白乙酰化共定位；海马ACSS2敲低损害物体位置记忆并减弱训练诱导的即刻早期基因上调。
- 研究意义
- 揭示了细胞代谢与神经可塑性之间的独特联系，将染色质局部乙酰辅酶A生成与组蛋白乙酰化及关键神经元基因转录联系起来，为神经和认知障碍的治疗提供了新的酶靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ACSS2敲低对神经元基因表达的影响
验证ACSS2在神经元分化相关基因表达程序中的作用。
分化前感染shACSS2或shACL慢病毒，分化后RNA-seq和Western blot检测神经元标志物。
ACSS2抑制剂对神经元基因表达的影响
验证ACSS2催化活性对神经元基因表达的必要性。
分化CAD神经元用ACSS2i处理24小时，RNA-seq分析基因表达变化。
ACSS2染色质结合与组蛋白乙酰化分析
探究ACSS2是否直接结合染色质并与组蛋白乙酰化共定位。
分化CAD神经元和鼠海马组织进行ACSS2、H3K9ac、H4K5ac、H4K12ac的ChIP-seq。
ACSS2对核乙酰辅酶A和组蛋白乙酰化的影响
验证ACSS2酶活性和敲低对核乙酰辅酶A水平及全局组蛋白乙酰化的影响。
ACSS2敲低或抑制剂处理后，检测核乙酰辅酶A水平（PicoProbe assay）和组蛋白乙酰化（Western blot）。
海马ACSS2敲低对空间记忆的影响
验证ACSS2在体海马空间记忆中的作用。
AAV9.shACSS2注射至背侧海马，4周后进行物体位置记忆训练和24小时保留测试。
海马ACSS2敲低对训练诱导基因表达的影响
验证ACSS2在体调控记忆相关即刻早期基因的上调。
行为训练后收集背侧海马进行RNA-seq，比较训练和未训练组基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM:HAMS F12 (1:1)培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| ACSS2抑制 | ACSS2抑制剂 | ChemBridge | -- |
| RNA-seq | Dynabeads mRNA直接提取试剂盒 | Ambion | -- |
| ScriptSeq v2 RNA-seq文库制备试剂盒 | Epicentre | -- | |
| ChIP-seq | Covaris S220超声破碎仪 | Covaris | -- |
| 蛋白A Dynabeads | Life Technologies | -- | |
| NEBNext Ultra文库制备 | NEB | -- | |
| 乙酰辅酶A定量 | PicoProbe乙酰辅酶A检测试剂盒 | Abcam | ab87546 |
| Synergy™ HTX多模式微孔板阅读器 | BioTek Instruments | -- | |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂混合物 | Life Technologies | #78446 |
| 培养细胞亚细胞分级分离试剂盒 | Thermo Scientific | 78840 | |
| BCA蛋白浓度测定 | Life Technologies | 23227 | |
| 苯甲酸酶 | Novagen | 70746 | |
| Fujifilm LAS-4000成像仪 | Fujifilm | -- | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor® 488鬼笔环肽 | Thermo | A12379 |
| ProLong Gold抗淬灭封片剂 | Invitrogen | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| Nikon Eclipse显微镜 | Nikon | -- | |
| 抗体 | 抗H3抗体 | Abcam | ab1791 |
| 抗H3K9ac抗体 | Abcam | ab4441 | |
| 抗H3K27ac抗体 | Abcam | ab4729 | |
| 抗H3K122ac抗体 | Abcam | ab33308 | |
| 抗H4抗体 | Millipore | 05-858 | |
| 抗H4K5ac抗体 | Millipore | 39-584 | |
| 抗H4K12ac抗体 | Abcam | ab1761 | |
| 抗ACSS2 (T)抗体 | Thermo | MA5-145810 | |
| 抗ACSS2 (CS)抗体 | Cell Signaling | 3658 | |
| 抗ACL抗体 | Proteintech | 15421-1-AP | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Sigma | T8328 | |
| 抗GAPDH抗体 | Fitzgerald Industries | 10R-G109A | |
| 抗KAT3A/CBP抗体 | Abcam | ab2832 | |
| 抗SNAP25抗体 | Abcam | ab5666 | |
| 抗突触素抗体 | Millipore | MAB368 | |
| 抗MAP2 C/D抗体 | Cell Signaling | #8707 | |
| 抗NR4A2抗体 | Santa Cruz | sc-991 | |
| 抗NeuN抗体 | Millipore | ABN78 | |
| 动物实验 | 异氟烷 | -- | -- |
| 布比卡因 | -- | -- | |
| 美洛昔康 | -- | -- | |
| AAV2/9.U6.shACSS2.CMV.EGFP病毒载体 | -- | -- | |
| AAV2/9.CMV.EGFP.polyA病毒载体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CAD神经元分化与ACSS2敲低 | 细胞密度50-60%时血清剥夺，分化5天；shRNA序列#TRCN0000076124和#TRCN0000076125；puromycin 0.5 mg/mL筛选5天 阅读提示：Methods – Cell Culture |
| ACSS2抑制剂处理 | ACSS2i浓度20 μM，处理24小时，DMSO对照 阅读提示：Methods – Cell Culture |
| ChIP-seq | ACSS2 ChIP使用2000 μg提取物和4 μg抗体；其他ChIP使用500 μg提取物和4 μg抗体；染色质剪切至<500 bp 阅读提示：Methods – Chromatin immunoprecipitation followed sequencing |
| 海马ACSS2敲低 | AAV9注射坐标AP −2.0mm, DV −1.4mm, ML +/−1.5mm；注射后4周进行行为学；每组n=10 阅读提示：Methods – Intracranial injection of viral vector; Figure 4 legend |
| 物体位置记忆测试 | 训练：3个物体，3次6分钟，间隔3分钟；24小时后测试5分钟；记录探索时间 阅读提示：Methods – Object location memory (OLM) task |
| 海马RNA-seq | 训练后敏感期收集背侧海马；每组4只动物，2次重复；使用Cuffdiff分析差异表达 阅读提示：Methods – RNA-seq; Results 'ACSS2 regulates upregulation of immediate-early genes' |