细胞模型的建立与表征
获得潜伏脑转移细胞并验证其代谢和线粒体特征。
通过体内表型筛选从HCC1954和SKBR3细胞中分离Lat细胞，并检测其脂肪酸代谢基因表达、脂质含量和线粒体形态。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
通过靶向DRP1限制线粒体可塑性可诱导代谢重编程并减少乳腺癌脑转移
Limiting mitochondrial plasticity by targeting DRP1 induces metabolic reprogramming and reduces breast cancer brain metastases
实验完整度
高包含体外细胞模型、体内动物模型、患者样本分析及功能验证（DRP1敲低和药理学抑制）和机制验证（代谢示踪）。
主要模型
HCC1954 HER2+乳腺癌细胞系（Pa、Lat、M-BM） SKBR3 HER2+乳腺癌细胞系（Pa、Lat、M-BM） 雌性无胸腺裸鼠（Hsd: athymic nude mice-Foxn1nu）脑转移模型 HER2+乳腺癌患者配对原发肿瘤和异时性脑转移样本
重点核对
DRP1和p-DRP1S616在Lat和M-BM细胞中的表达水平 线粒体形态（管状、中间、点状）的分布 13C16棕榈酸示踪中FAO相关代谢物（柠檬酸、谷氨酸、苹果酸、GSH、GSSG）的M+2同位素富集 DRP1或CPT1A敲低后对肿瘤球形成和脑转移的影响 Mdivi-1（40 mg/kg）口服给药对脑转移负担的效果
摘要
播散的肿瘤细胞具有代谢灵活性，能够利用远端器官中可用的营养物质持续存在，但促进代谢适应的精确机制仍不清楚。在这里，我们展示了潜伏性脑转移（Lat）细胞中碎片化的线粒体斑点能够使脂肪酸氧化（FAO）维持细胞生物能量并保持氧化还原稳态。消耗富集的动力相关蛋白1（DRP1）并限制Lat细胞中的线粒体可塑性，导致脂滴积累增加、FAO受损和转移减弱。同样，使用一种小分子脑渗透性抑制剂对DRP1进行药理学抑制，在临床前模型中减弱了转移负担。与这些发现一致，在异时性脑转移中观察到磷酸化DRP1表达增加，与患者匹配的原发肿瘤相比。总的来说，我们的发现揭示了线粒体可塑性在支持Lat细胞存活中的关键作用，并强调了靶向细胞可塑性程序与肿瘤特异性改变相结合以预防转移复发的治疗潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 潜伏脑转移细胞如何通过代谢适应在脂质丰富的脑微环境中存活并启动转移复发？
- 核心机制
- DRP1介导的线粒体碎片化促进脂肪酸氧化，为潜伏转移细胞提供能量并维持氧化还原稳态。
- 主要证据
- 体外共培养显示Lat细胞摄取星形胶质细胞分泌的脂肪酸；13C16棕榈酸示踪显示FAO增强；DRP1或CPT1A敲低导致FAO受损、ROS升高和细胞死亡；体内敲低或Mdivi-1抑制DRP1减少脑转移负担；患者样本中p-DRP1S616在脑转移中高表达。
- 研究意义
- 靶向线粒体可塑性有望成为预防转移复发的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
脂肪酸摄取与脂滴积累分析
验证Lat细胞是否从星形胶质细胞摄取脂肪酸并以脂滴形式储存。
将BODIPY-C12标记的星形胶质细胞与癌细胞共培养，观察脂滴转移；检测Lat细胞对脂肪酸处理的反应。
脂肪酸氧化和氧化还原稳态检测
检测Lat细胞中脂肪酸氧化及其对氧化还原平衡的影响。
使用14C-棕榈酸和13C16-棕榈酸进行示踪，检测FAO速率、TCA循环中间体富集和谷胱甘肽水平；测量ROS水平。
DRP1或CPT1A功能缺失实验
验证DRP1和CPT1A在FAO和线粒体动态中的必要性。
通过dox诱导shRNA敲低DRP1或CPT1A，观察线粒体形态、脂滴积累、FAO、ROS、细胞活力和肿瘤球形成的变化。
体内转移实验
评估DRP1或CPT1A缺失对脑转移的影响。
将对照和敲低细胞心内注射入小鼠，通过dox饮食诱导敲低，通过IHC和生物发光成像评估脑转移负担。
DRP1药理学抑制实验
验证DRP1抑制剂Mdivi-1对脑转移的治疗效果。
对荷瘤小鼠口服Mdivi-1（40 mg/kg）每天一次共4周，评估脑转移负担和体重的变化。
患者样本分析
验证p-DRP1S616在人类异时性脑转移中的表达。
对HER2+乳腺癌患者匹配的原发肿瘤和脑转移样本进行IHC染色，评估p-DRP1S616表达水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Sigma-Aldrich | R8758 |
| DMEM高糖培养基 | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| 星形胶质细胞生长添加物 | ScienCell Research Laboratories | 1852 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| 棕榈酸钠 | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| 脂肪酸摄取实验 | BODIPY-558/568-C12 | Thermo Fisher Scientific | D3835 |
| 细胞追踪 | 绿色细胞追踪染料 | Thermo Fisher Scientific | C7025 |
| 线粒体染色 | MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 |
| ROS检测 | CellROX Deep Red试剂 | Thermo Fisher Scientific | C10422 |
| 细胞凋亡检测 | APC Annexin V | BioLegend | 640932 |
| Caspase-3活性检测试剂盒 | Abcam | ab39401 | |
| 细胞活性检测 | MTT | Sigma-Aldrich | M5655 |
| CellTiter-Glo发光细胞活力测定试剂盒 | Promega | G9241 | |
| 脂滴染色 | 尼罗红 | -- | -- |
| 油红O | -- | -- | |
| Western blot | West Femto Super Signal底物 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 免疫组织化学 | 抗GFAP抗体 | -- | -- |
| 抗磷酸化DRP1S616抗体 | Cell Signaling Technology | 4494 | |
| 核染色 | Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | 62249 |
| 动物实验 | 多西环素 | Sigma-Aldrich | 3072 |
| Mdivi-1 | Selleckchem | S7162 | |
| 抗asialo-GM1多克隆抗体 | FUJIFILM Wako Shibayagi | 986-10001 | |
| 同位素示踪 | 13C16棕榈酸 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-6059 |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Biological Industries | 01-101-1A |
| 病毒包装 | Lipofectamine 3000 | Invitrogen | -- |
| PEG-it病毒沉淀溶液 | System Biosciences | LV810A-1 | |
| 透射电镜 | Tecnai G2 Spirit透射电镜 | FEI | -- |
| 成像 | Nikon CSU-W1转盘共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| IncuCyte3成像系统 | -- | -- | |
| EVOS荧光显微镜 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | FACSCalibur流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- |
| GC-MS | Agilent 7890/5975C气相色谱-质谱联用仪 | Agilent | -- |
| LC-MS | Orbitrap Fusion Lumos质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Ultimate 3000 RSLC-Nano液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 小动物成像 | AMI-HTX小动物成像仪 | -- | -- |
| FAO测定 | MicroBeta2微孔板计数器 | PerkinElmer | -- |
| 分析软件 | FlowJo v10软件 | -- | -- |
| BD FACSDiva v9.0.1软件 | -- | -- | |
| MassHunter v.B08软件 | Agilent | -- | |
| Image Lab v6.1软件 | Bio-Rad | -- | |
| Proteome Discoverer v2.4 SP1软件 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 统计软件 | GraphPad Prism 9统计软件 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基、血清浓度、培养条件和传代比例 阅读提示：Methods: Cell lines |
| 脂肪酸摄取实验 | BODIPY-C12浓度、标记时间、共培养时间、细胞密度 阅读提示：Methods: BODIPY-558/568-C12 transfer assays; Figure 1 legends |
| 代谢示踪 | 13C16-棕榈酸浓度、处理时间、样本制备方法 阅读提示：Methods: In vitro 13C16 palmitic acid tracing; Figure 2 legends |
| 功能缺失实验 | shRNA序列、诱导条件（dox浓度）、处理时间 阅读提示：Methods: Virus production and infection; Figure 3 legends |
| 体内实验 | 细胞注射数量、注射方式、dox饮食开始时间、肿瘤负荷评估时间点 阅读提示：Methods: Intracardiac injections and in vivo mice studies; Figure 4 legends |
| 药理学抑制 | Mdivi-1剂量、给药方式、给药频率和持续时间 阅读提示：Methods: Mdivi-1 oral gavage; Figure 6 legends |