ccRCC代谢组学与基因集分析
鉴定ccRCC中一致缺失的代谢酶
对20例原发ccRCC肿瘤及配对正常肾组织进行泛代谢组学分析；对TCGA ccRCC RNAseq数据进行代谢基因集分析。
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果糖-1,6-二磷酸酶抑制肾癌进展
Fructose-1,6-bisphosphatase opposes renal carcinoma progression.
实验完整度
高包含患者肿瘤代谢组学、细胞系功能验证、小鼠移植瘤模型及分子机制验证等多层级证据
主要模型
786-O ccRCC细胞系 RCC10和RCC4 VHL缺陷ccRCC细胞系 HK-2近端肾小管上皮细胞 786-O细胞皮下移植瘤 nude mice 模型
重点核对
786-O细胞在1% FBS低血清培养基中的生长及移植瘤终点重量 HK-2细胞在10 mM或1 mM葡萄糖条件下的葡萄糖摄取和乳酸分泌 RCC10细胞中FBP1野生型与G260R突变体对HIF报告基因活性的影响 ChIP和ChIP-reChIP检测FBP1与HIF1α在HREs的共定位 TCGA ccRCC 480例肿瘤与69例正常肾组织的FBP1表达及生存分析
摘要
透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是最常见的肾癌类型，以糖原和脂肪沉积升高为特征。这些一致的代谢改变与缺氧诱导因子（HIF）在常氧下的稳定有关，而后者继发于超过90%的ccRCC肿瘤中发生的von Hippel-Lindau（VHL）突变。然而，小鼠肾脏特异性VHL缺失未能引发ccRCC特异性代谢表型和肿瘤形成，提示其他机制必不可少。近期大规模测序分析揭示了一部分ccRCC中多种染色质重塑酶的缺失（polybromo 1 [PBRM1] ~40%、SET domain containing 2 [SETD2] ~15%、BRCA1 associated protein-1 [BAP1] ~15%等），表明表观遗传扰动可能是该疾病自然史的重要贡献者。在此，我们采用整合方法，包括泛代谢组学分析和代谢基因集分析，确定糖异生酶果糖-1,6-二磷酸酶1（FBP1）在所检测的超过600个ccRCC肿瘤中一致缺失。重要的是，人FBP1基因座位于染色体9q22，其缺失与ccRCC患者不良预后相关。我们的数据进一步表明，FBP1通过两种不同机制抑制ccRCC进展：1）FBP1拮抗肾小管上皮细胞（推定的ccRCC细胞来源）中的糖酵解通量，从而抑制潜在的“Warburg效应”；2）在pVHL缺陷的ccRCC细胞中，FBP1以不依赖催化活性的方式，通过直接与HIF“抑制结构域”相互作用抑制核内HIF功能，从而限制细胞增殖、糖酵解和戊糖磷酸途径。FBP1蛋白这种独特的双重功能解释了其在ccRCC中的普遍缺失，将FBP1与先前鉴定的肿瘤抑制因子（PBRM1、SETD2、BAP1等）区分开来，后者并非在所有肿瘤中一致突变。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FBP1在ccRCC中是否缺失及其抑制肿瘤进展的机制是什么？
- 核心机制
- FBP1通过两种机制抑制ccRCC：在肾小管上皮细胞中拮抗糖酵解通量；在pVHL缺陷ccRCC细胞中，以不依赖催化活性的方式与HIFα的抑制结构域直接结合，抑制核内HIF功能。
- 主要证据
- 泛代谢组学显示ccRCC肿瘤糖酵解/糖异生相关代谢物升高；FBP1在>600例ccRCC中普遍缺失；过表达FBP1抑制786-O等细胞生长和移植瘤生长；FBP1 G260R突变体仍抑制HIF活性；ChIP和GST pull-down证实FBP1与HIFα直接结合。
- 研究意义
- 揭示了FBP1与缺氧反应之间的调控关系，对糖异生组织的代谢调控具有启示意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
FBP1在ccRCC中的表达验证
确认FBP1在ccRCC肿瘤中的蛋白缺失及其与预后的关系
免疫组化检测肾组织芯片中FBP1表达；分析TCGA中FBP1表达与肿瘤分期及患者生存的关系。
FBP1对肿瘤细胞生长的功能验证
验证FBP1对ccRCC细胞增殖和移植瘤生长的影响
在786-O、RCC10、769-P细胞中过表达FBP1，检测低血清生长、锚定非依赖生长和裸鼠移植瘤生长；在HK-2细胞中敲低FBP1检测生长。
FBP1对糖代谢的调控验证
验证FBP1对糖酵解、戊糖磷酸途径和NADPH水平的影响
在HK-2细胞中敲低FBP1、在RCC10细胞中过表达FBP1，检测葡萄糖摄取、乳酸分泌、13C同位素示踪的TCA中间产物、NADPH水平和PPP通量。
FBP1抑制HIF活性的分子机制
验证FBP1是否通过直接结合HIFα抑制其转录活性及是否依赖催化活性
HIF报告基因检测、HIF靶基因qRT-PCR、ChIP和ChIP-reChIP、免疫共沉淀、GST pull-down、GAL4反式激活实验、FBP1截短体和G260R突变体实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体检测 | HDAC1抗体 | Cell Signaling Technology | 5356 |
| HSP90抗体 | Cell Signaling Technology | 4877 | |
| GST抗体 | Cell Signaling Technology | 2625 | |
| HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 正常兔IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| 正常小鼠IgG | Cell Signaling Technology | 5415 | |
| HIF1α抗体 | Novus | NB100-134 | |
| HIF2α抗体 | Novus | NB100-122 | |
| PCK1抗体 | Abcam | ab28455 | |
| G6PC抗体 | Abcam | ab83690 | |
| PFKL抗体 | Abcam | ab37583 | |
| FBP1抗体 | Sigma | SAB1405798 | |
| FBP1抗体 | Sigma | HPA005857 | |
| 酶活实验 | D-果糖-1,6-二磷酸三钠盐 | Sigma | 47810 |
| 锚定非依赖生长实验 | 2-羟乙基琼脂糖 | Sigma | A4018 |
| 细胞培养 | 角质形成细胞无血清培养基 | Life Technologies | -- |
| 人重组表皮生长因子1-53 | Life Technologies | -- | |
| 牛垂体提取物 | Life Technologies | -- | |
| 代谢标记 | 无葡萄糖DMEM | Life Technologies | -- |
| 透析胎牛血清 | Gemini Bio Products | -- | |
| [1,2-13C]葡萄糖 | Cambridge isotope | -- | |
| 无谷氨酰胺DMEM | Life Technologies | -- | |
| [U-13C]谷氨酰胺 | Cambridge isotope | -- | |
| 质粒构建 | QuikChange II定点突变试剂盒 | Agilent | -- |
| 质粒转染 | Lipofectamine LTX转染试剂 | Life Technologies | -- |
| 病毒浓缩 | 0.45 µM Steriflip过滤器 | Millipore | -- |
| 病毒感染 | 聚凝胺 | Sigma | -- |
| 代谢物检测 | YSI 7100多参数生物分析系统 | YSI Life Sciences | -- |
| NADPH检测 | NADP+/NADPH定量试剂盒 | BioVision | -- |
| G6P检测 | PicoProb G6P荧光检测试剂盒 | BioVision | -- |
| 泛代谢组学分析 | MicroLab STAR系统 | Hamilton | -- |
| Thermo-Finnigan Trace DSQ快速扫描单四极杆质谱仪 | Thermo-Finnigan | -- | |
| Waters ACQUITY超高效液相色谱 | Waters | -- | |
| Thermo-Finnigan LTQ质谱仪 | Thermo-Finnigan | -- | |
| 13C代谢通量分析 | AG-1柱 | Bio-rad | 100–200 mesh, 0.5 × 2.5 cm |
| 免疫沉淀 | 蛋白G珠 | Life Technologies | -- |
| Western blot | 硝酸纤维素膜 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Cell Signaling Technology | -- | |
| ECL试剂 | Pierce | -- | |
| RNA提取 | RNAeasy纯化试剂盒 | Qiagen | -- |
| cDNA合成 | High Capacity RNA-to-cDNA预混液 | Applied Biosystems | -- |
| qRT-PCR | TaqMan通用PCR试剂 | Applied Biosystems | -- |
| ViiA7实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| ChIP | QuikChIP试剂盒 | Novus | -- |
| V5抗体 | Life Technologies | -- | |
| RNA聚合酶II抗体 | Imgenex | -- | |
| QIAquick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶检测试剂盒 | Promega | -- |
| GAL4反式激活实验 | pBIND载体 | Promega | -- |
| 亚细胞组分分离 | NE-PER核质分离试剂 | Pierce | -- |
| 酶活实验 | 去蛋白样品制备试剂盒 | BioVision | -- |
| PicoProb果糖-6-磷酸荧光检测试剂盒 | BioVision | -- | |
| 氧消耗实验 | MitoXpress探针溶液 | Cayman Chemical | -- |
| SpectraMax m2e酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| 蛋白纯化 | BL21-DE3化学感受态大肠杆菌 | Life Technologies | -- |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 | Denville Scientific | -- | |
| GST包涵体溶解和复性试剂盒 | Cell Biolabs | -- | |
| GST pull-down | GST蛋白相互作用Pull-Down试剂盒 | Pierce | -- |
| 谷胱甘肽琼脂糖 | Pierce | -- | |
| 免疫组化 | 柠檬酸基抗原修复液 | Vector Labs | -- |
| 亲和素/生物素封闭试剂盒 | Vector Labs | -- | |
| Vectastain ABC试剂盒 | Vector Labs | -- | |
| ImmPACT DAB底物 | Vector Labs | -- | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488酪胺（TSA试剂盒#22） | Life Technologies | -- |
| ProLong Gold抗淬灭试剂 | Life Technologies | -- | |
| 动物实验 | 基质胶 | BD Bioscience | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞生长实验 | 786-O细胞接种密度5×10^4 cells/well、1% FBS低血清培养基、每日计数 阅读提示：Methods中的Cell growth assay小节 |
| 移植瘤实验 | 五只雌性NIH-III nude mice（4–6周）、双侧胁部注射5×10^6 786-O细胞、matrigel混合比例1:1、四周期限、终点肿瘤重量 阅读提示：Methods中的Animal studies小节及Figure 1f图注 |
| 代谢标记实验 | [1,2-13C]葡萄糖标记48小时、[U-13C]谷氨酰胺标记3小时、10 mM或2 mM浓度、10%透析FBS 阅读提示：Methods中的Cell culture和13C-metabolic flux analysis小节 |
| HIF报告基因实验 | 0.5 mg HRE报告质粒、0.05 mg Renilla、1 mg表达或shRNA质粒、转染后48小时检测 阅读提示：Methods中的Luciferase reporter and GAL4 transactivation assay小节 |
| ChIP实验 | 三百万RCC10细胞、1%甲醛交联15分钟、染色质片段200–1000 bp、5 µg抗体、qRT-PCR引物序列 阅读提示：Methods中的Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-reChIP assay小节 |