EMS诱变筛选和突变体鉴定
利用EMS诱变产生感病突变体，以用于克隆Lr9/Lr58。
对TcLr9（919个M2家系）和TA5605（约7400个M2家系）进行EMS处理，筛选对叶锈菌敏感突变体，共鉴定17个TcLr9感病突变体和104个TA5605感病突变体。
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一种不寻常的串联激酶融合蛋白赋予小麦叶锈病抗性
An unusual tandem kinase fusion protein confers leaf rust resistance in wheat
实验完整度
高研究包含EMS诱变筛选、转录组测序、病毒诱导基因沉默、单倍型分析、细胞遗传学分析和基因组组装等多层面的独立证据，并有功能验证。
主要模型
小麦品系TcLr9（Transfer/6*Thatcher） 小麦品系TA5605（Lr58携带者） 伞穗山羊草（Aegilops umbellulata）TA1851 三芒山羊草（Aegilops triuncialis）TA10438
重点核对
EMS诱变剂量：TcLr9和TA5605分别用0.45%和0.55% EMS处理16小时 MutIsoSeq筛选突变体数量：TcLr9 919个M2家系，TA5605约7400个M2家系 VIGS沉默靶点：WTK6-vWA的VIGS1和VIGS2片段长度分别为223 bp和226 bp Lr9供体鉴定：仅伞穗山羊草TA1851携带Lr9，三芒山羊草TA10438不携带 易位断点定位：Lr9易位位于小麦6BL染色体臂725.61 Mb处，并缺失5.58 Mb小麦片段
摘要
将野生近缘种的染色体片段渐渗是丰富作物种质资源抗病基因的既定策略。本文利用诱变和转录组测序克隆了从野生禾本科物种伞穗山羊草中导入普通小麦的叶锈病抗性基因Lr9。我们确定Lr9编码一种不寻常的串联激酶融合蛋白。对小麦Lr9渐渗系和推定伞穗山羊草Lr9供体的长读长测序，使我们能够组装约28.4 Mb的Lr9易位片段，并鉴定易位断点。我们还克隆了据报道从三芒山羊草渐渗的Lr58，但其编码序列与Lr9相同。细胞遗传学和单倍型分析证实这两个基因来源于同一易位事件。我们的工作揭示了激酶融合蛋白在小麦抗病性中的新兴作用，扩大了可用于育种的抗病基因库。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 小麦叶锈病抗性基因Lr9/Lr58的分子身份及其抗病机制是什么？
- 核心机制
- Lr9编码的WTK6-vWA蛋白包含两个激酶结构域和vWA/Vwaint结构域，可能通过第二个激酶和vWA/Vwaint结构域作为诱饵，感知病原菌效应子，而激酶1活性触发防御反应。
- 主要证据
- 基于EMS诱变筛选和MutIsoSeq转录组测序鉴定到Lr9候选基因，通过Sanger测序在120个突变体中定义97个独立突变事件，并通过VIGS验证沉默WTK6-vWA增加叶锈病易感性。
- 研究意义
- 该研究揭示了激酶融合蛋白在小麦抗病中的新兴作用，扩大了可用于育种的抗病基因库。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
MutIsoSeq转录组分析
通过比较野生型和突变体的转录本，鉴定与抗病相关的候选基因。
利用Iso-seq获得野生型TcLr9和TA5605的全长转录本作为参考，将10个TcLr9和10个TA5605突变体的RNA-seq reads比对到参考，筛选出在所有突变体中均带有EMS型点突变的转录本，最终候选为WTK6-vWA。
基因全长扩增和Sanger测序验证
通过Sanger测序验证候选基因在所有突变体中的突变，确定其与抗病表型的关联。
对TcLr9和TA5605背景中剩余的101个突变体，用特异性引物扩增WTK6-vWA基因区并进行Sanger测序，检测到错义或提前终止突变。
病毒诱导基因沉默（VIGS）
通过沉默WTK6-vWA基因，验证其在叶锈病抗性中的功能。
构建针对WTK6-vWA的BSMV-VIGS载体，在本氏烟草中扩增后接种TcLr9和TA5605幼苗叶片，然后接种叶锈菌B9414，评估基因沉默对抗病性的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | Maxwell RSC植物RNA提取试剂盒 | Promega | AS1500 |
| Iso-seq文库制备 | SMRTbell Express模板制备试剂盒2.0 | Pacific Biosciences | 100-938-900 |
| Sequel II结合试剂盒2.1 | Pacific Biosciences | -- | |
| 内部对照试剂盒1.0 | Pacific Biosciences | 101-843-000 | |
| Iso-seq测序 | Sequel II测序试剂盒2.0 | Pacific Biosciences | 101-820-200 |
| PCR扩增 | GoTaq Green预混液 | Promega | M7122 |
| VIGS | 硅藻土 | Thermo Fisher Scientific | 68855-54-9 |
| HiFi文库制备 | Express模板制备试剂盒2.0 | Pacific Biosciences | 100-938-900 |
| 酶切纯化试剂2.0 | Pacific Biosciences | 101-932-600 | |
| Megaruptor 3 | Diagenode | -- | |
| PippinHT系统 | Sage Science | HTP0001 | |
| Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Q33230 | |
| FEMTO脉冲电泳系统 | Agilent Technologies | P-0003-0817 | |
| HiFi测序 | PacBio Sequel II/IIe测序系统 | Pacific Biosciences | -- |
| RNA-seq | Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| RT-qPCR | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Thermo Fisher Scientific | A25742 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EMS诱变 | EMS浓度：TcLr9为0.45%，TA5605为0.55%；处理时间：16小时；处理温度：室温 阅读提示：Methods: EMS mutagenesis and mutant screening |
| MutIsoSeq | 突变体数量：10个TcLr9和10个TA5605感病突变体；测序平台：PacBio Sequel II和Illumina NovaSeq 6000；比对参数：BBMap v38.96 with subfilter=1 and ambiguous=best 阅读提示：Methods: MutIsoSeq |
| VIGS | VIGS靶点：WTK6-vWA的VIGS1和VIGS2片段长度分别为223 bp和226 bp；农杆菌菌株：GV3101；叶片浸润后5天收集；对两叶期幼苗进行摩擦接种 阅读提示：Methods: Virus-induced gene silencing |
| KASP | KASP反应体系：2.5 μL KASP Master Mix (Low ROX KBS-1016-016)，0.07 μL assay mix，2.5 μL（50 ng）DNA；PCR程序：94°C 15 min，10个降落循环（94°C 20 s；61°C降至55.4°C，每循环降0.6°C，60 s），29个额外循环（94°C 20 s；55°C 60 s） 阅读提示：Methods: KASP assay |