泛素化位点占据度定量
在蛋白质组规模上定量泛素化位点的占据度（化学计量）。
利用GG残基 profiling、部分化学GG修饰和系列稀释SILAC（SD-SILAC）定量HeLa细胞中泛素化位点占据度。
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泛素化位点占据度与周转率的全局、位点分辨分析揭示系统特性
Global, site-resolved analysis of ubiquitylation occupancy and turnover rate reveals systems properties.
实验完整度
高多细胞系SILAC-MS定量占据度和半衰期，结合抑制剂处理、免疫印迹及结构映射验证
主要模型
HeLa细胞 HCT116细胞 NIH-3T3细胞
重点核对
HeLa细胞中泛素化位点占据度：7个生物学重复，PC-GG稀释梯度3%/1%/0.1%/0.01%/0.001% HeLa细胞中泛素化位点半衰期：TAK-243（100 μM）处理0/5/10/30/60 min，5个生物学重复 蛋白酶体抑制调控：MG-132（200 μM）或BTZ（100 μM）处理2.5 h，部分联合TAK-243（100 μM） E1/E2快速去泛素化：HeLa、HCT116和NIH-3T3中位半衰期≤5 min
摘要
泛素化调节真核细胞中大多数蛋白质和生物学过程。然而，泛素化位点特异性占据度（化学计量）和周转率尚未被定量。本文呈现了全局泛素化位点占据度和半衰期的整合图景。泛素化位点占据度跨越四个数量级，但中位泛素化位点占据度比磷酸化低三个数量级。占据度、周转率以及位点受蛋白酶体抑制剂调控的程度强烈相互关联，这些属性区分了参与蛋白酶体降解的位点与参与细胞信号传导的位点。结构化蛋白质区域内的位点比非结构化区域内的位点表现出更长的半衰期和更强的蛋白酶体抑制剂上调。重要的是，我们发现了一种监视机制，该机制快速且位点非特异性地去泛素化所有泛素特异性E1和E2酶，保护它们免于旁观者泛素化的积累。该工作提供了泛素化特性的系统规模、定量视图，并揭示了泛素化依赖的调控的一般原理。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 泛素化位点的全局占据度和周转率如何？不同位点的占据度、半衰期和蛋白酶体调控如何相互关联？
- 核心机制
- 泛素化以低占据度和快速周转运行；存在一种监视机制快速且位点非特异性地去泛素化泛素特异性E1和E2酶，防止旁观者泛素化积累。
- 主要证据
- 通过SILAC-MS在HeLa细胞中定量11,403个位点占据度（中位0.0081%）和13,833个位点半衰期（中位约12 min）；E1/E2位点中位半衰期2.3 min，且在HCT116和NIH-3T3中保守。
- 研究意义
- 提供了泛素化系统的定量图景，揭示泛素化依赖的细胞调控的设计原理，并提示E1/E2监视机制可能被病原体规避。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
泛素化位点半衰期定量
定量泛素化位点的去泛素化速率（半衰期）。
用E1抑制剂TAK-243处理细胞，通过SILAC-MS时间进程定量泛素化位点衰减，拟合指数或指数-平台模型计算半衰期。
蛋白酶体抑制对泛素化的调控分析
研究蛋白酶体活性对泛素化位点调控和去泛素化的影响。
单独或联合使用蛋白酶体抑制剂MG-132、BTZ与E1抑制剂TAK-243，定量泛素化位点变化。
PSMD14/JAMM家族在去泛素化中的作用
检验JAMM家族金属蛋白酶（含PSMD14）对去泛素化的贡献。
使用JAMM家族抑制剂thiolutin（THL）联合TAK-243处理细胞，定量泛素化位点变化。
蛋白质合成抑制对膜受体泛素化的影响
检验细胞外结构域位点是否在新合成受体上被泛素化。
用环己酰亚胺（CHX）抑制蛋白质合成，分析质膜跨膜受体泛素化位点变化。
多细胞系验证泛素化半衰期
验证泛素化快速周转及E1/E2快速去泛素化是否保守。
在HCT116和NIH-3T3细胞中重复TAK-243时间进程实验，定量泛素化位点半衰期。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达与修饰变化
数据分析与统计
结构映射与暴露预测
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 化学GG修饰 | Boc-Gly-Gly-NHS | A ChemTek Inc. | 29248-48-4 |
| SILAC标记 | L-赖氨酸4,4,5,5-D4 | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2640 |
| L-精氨酸13C6 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-2265-H | |
| L-赖氨酸13C615N2 | Cambridge Isotope Laboratories | CNLM-291-H | |
| L-精氨酸13C615N4 | Cambridge Isotope Laboratories | CNLM-593-H | |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F0392 |
| L-谷氨酰胺 | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| E1抑制 | TAK-243 | Chemgood | 1450833-55-2 |
| 蛋白酶体抑制 | MG-132 | Enzo Life Sciences | 133407-82-6 |
| 硼替佐米 | Selleckchem | 179324-69-7 | |
| PSMD14抑制 | 硫藤黄菌素 | Abcam | 87-11-6 |
| 蛋白质酶解 | 蛋白质组学级胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T6567 |
| GG修饰肽段富集 | PTMScan泛素残基基序（K-ε-GG）试剂盒 | Cell Signaling Technology | 5562 |
| 蛋白定量 | Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 |
| Quickstart Bradford测定 | BioRad | 500-0205 | |
| Western blot | 抗β-肌动蛋白抗体，克隆AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 |
| 抗单泛素化和多泛素化缀合物抗体（FK2） | Enzo Life Sciences | BML-PW8810 | |
| 抗泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 3933 | |
| HRP标记抗小鼠IgG | Jackson ImmunoResearch Labs | 115-036-062 | |
| HRP标记抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch Labs | 111-036-045 | |
| ECL化学发光底物试剂盒 | Novex, Thermo Fisher Scientific | WP20005 | |
| 泛素绝对定量 | 合成肽ESTLHLVLR[+10Da] HVYPEP AQUA QUANTPRO NMOD ∼25% | Life Technologies | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 泛素化位点占据度定量 | PC-GG标准品稀释梯度及批次差异（批次1度4.04%，批次2度11.28%） 阅读提示：STAR Methods中“Sample preparation for native ubiquitylation occupancy measurements”及Figure S1、S2 |
| 泛素化位点半衰期定量 | TAK-243浓度（100 μM）、处理时间点（0/5/10/30/60 min）及生物学重复数 阅读提示：STAR Methods中“Sample preparation for ubiquitylation half-life quantification”及Figure S4C |
| 蛋白酶体抑制调控分析 | MG-132（200 μM）或BTZ（100 μM）处理时间2.5 h；TAK-243联合处理时序 阅读提示：STAR Methods中“Sample preparation for ubiquitylation analysis after proteasome inhibitor treatment”及Figure 3C |
| E1/E2快速去泛素化验证 | HeLa、HCT116、NIH-3T3细胞中E1/E2位点半衰期及保守性 阅读提示：Figure 6、Figure S6B和S6C |