VSVΔG假型化验证肌肉融合蛋白功能
验证Myomaker和Myomerger能否在无细胞病毒膜上替代病毒融合蛋白驱动融合。
在BHK21生产细胞中多西环素诱导表达Myomaker和Myomerger，包装VSVΔG-GFP，免疫印迹确认病毒膜蛋白，VSV-G中和抗体处理后转导表达融合蛋白的BHK21及原代肌管。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
用哺乳动物肌源性细胞融合蛋白假型化的包膜病毒靶向骨骼肌用于基因递送
Enveloped viruses pseudotyped with mammalian myogenic cell fusogens target skeletal muscle for gene delivery.
实验完整度
高含VSVΔG与慢病毒假型化、原代肌管、mdx4cv小鼠局部及系统递送、功能与病理验证
主要模型
BHK21细胞及表达Myomaker/Myomerger的BHK21靶细胞 原代小鼠肌管、肌母细胞与10T½成纤维细胞 mdx4cv与Rosa26tdTomato报告小鼠 HEK293T慢病毒生产细胞
重点核对
假型病毒转导以GFP或Cre-tdTomato报告为读出 免疫印迹与免疫金电镜确认病毒膜上Myomaker/Myomerger mdx4cv小鼠胫骨前肌或跖肌局部注射108-109病毒颗粒 mdx4cv小鼠经三次逆行眶后注射系统递送μDys Myomaker在靶细胞中的必要性通过MymkloxP/loxP;Pax7CreER缺失验证
摘要
包膜病毒进入细胞由病毒融合蛋白介导，其驱动病毒膜与靶膜融合所需的膜重排。骨骼肌发育同样需要祖细胞间的膜融合事件以形成多核肌纤维。Myomaker与Myomerger是肌肉特异性细胞融合蛋白，但在结构或功能上均不类似经典病毒融合蛋白。我们提出问题：尽管肌肉融合蛋白结构独特，是否可功能性地替代病毒融合蛋白并使病毒与细胞融合。我们报道，将Myomaker与Myomerger工程化至包膜病毒膜上可导致对骨骼肌的特异性转导。我们还证明，局部和系统性注射假型化肌肉融合蛋白的病毒颗粒可将μDystrophin递送至杜氏肌营养不良小鼠模型的骨骼肌并缓解病理。通过利用肌源性膜的内在特性，我们建立了向骨骼肌递送治疗材料的平台。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Myomaker和Myomerger能否在缺乏完整细胞机器的无细胞膜上驱动融合，并替代病毒融合蛋白使包膜病毒靶向肌源性细胞递送治疗材料。
- 核心机制
- Myomaker和Myomerger可独立整合于病毒膜并驱动病毒-细胞融合，靶细胞表面Myomaker是转导所必需，病毒因此获得对表达肌源性融合蛋白细胞的特异性嗜性。
- 主要证据
- VSVΔG和慢病毒假型化后特异性转导表达Myomaker/Myomerger的BHK21细胞及原代肌管；mdx4cv小鼠局部与系统注射Mymk+Mymg-LV-μDys后检测到μDys表达、中心核化和纤维化减少、EBD摄取降低及比力增加。
- 研究意义
- 建立了利用肌源性膜内在特性向骨骼肌递送治疗材料的平台，并提示慢病毒假型可克服系统递送与重复给药的障碍。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
慢病毒假型化与体外嗜性验证
评估具治疗潜力的慢病毒能否被肌肉融合蛋白假型化并特异性转导肌源性细胞。
在诱导表达Myomaker/Myomerger的HEK293T中生产慢病毒，免疫印迹、透射电镜与免疫金电镜确认融合蛋白，转导BHK21靶细胞、肌管、肌母细胞和成纤维细胞并测定滴度。
体内局部递送与肌源性祖细胞靶向
验证局部注射假型慢病毒能否转导活化骨骼肌及肌源性祖细胞。
向Rosa26tdTomato和mdx4cv;Rosa26tdTomato小鼠胫骨前肌或跖肌注射Mymk+Mymg-LV-Cre，结合cardiotoxin损伤或肌肉过载，检测tdTomato并FACS分析α7-Integrin+细胞。
μDystrophin递送与病理缓解评估
验证假型慢病毒递送治疗性μDys能否改善营养不良肌肉病理与功能。
向mdx4cv小鼠注射Mymk+Mymg-LV-μDys，免疫组化与免疫印迹检测μDys，评估中心核化、纤维化、EBD摄取及肌肉比力。
靶细胞Myomaker必要性验证
确定靶细胞中Myomaker是否为假型病毒转导所必需。
在BHK21靶细胞分别表达Myomaker、Myomerger或两者后转导Mymk+Mymg-LV；在mdx4cv;MymkloxP/loxP;Pax7CreER小鼠中缺失Myomaker后递送Mymk+Mymg-LV-μDys。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Matrigel基底膜基质 | Corning | 354234 |
| 重组人碱性FGF | PeproTech | 100-18C | |
| 盐酸多西环素即用溶液 | Sigma Aldrich | D3072 | |
| 病毒包装转染 | FuGENE-6转染试剂 | Promega | E2692 |
| 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 24314-2 | |
| 病毒中和 | 抗VSV-G抗体 | Kerafast | 8G5F11 |
| 病毒转导 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 免疫印迹 | 羊抗Myomerger抗体 | R&D | AF4580 |
| 鼠抗GAPDH抗体 | Millipore | MAB374 | |
| 兔抗HIV-Gag抗体 | Abcam | ab63917 | |
| 鼠抗Dystrophin抗体 | DSHB | MANEX1011B | |
| 免疫金电镜 | 羊抗Myomaker抗体 | Santa Cruz | SC-244459 |
| 免疫组化 | 鼠抗Dystrophin抗体 | GeneTex | GTX01869 |
| 兔抗Laminin抗体 | Sigma Aldrich | L9393 | |
| 流式分析 | 鼠抗整合素α7抗体 | MBL International | K0046-3 |
| 肌肉损伤模型 | 心脏毒素 | EMD Millipore | 217503-1MG |
| 膜完整性检测 | 伊文思蓝染料 | Sigma Aldrich | E2129-10G |
| 生物发光成像 | D-荧光素 | Promega | E1605 |
| 细胞核染色 | Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 |
| 细胞膜标记 | Vybrant多色细胞标记试剂盒 | Invitrogen | V22889 |
| 病毒滴度检测 | Cytation 5细胞成像多模式检测仪 | BioTek | -- |
| Countess 3自动细胞计数仪 | Invitrogen | -- | |
| 蛋白检测 | Odyssey红外检测系统 | LI-COR Biosciences | -- |
| 电镜观察 | H-7650透射电子显微镜 | Hitachi | -- |
| 肌肉力量测定 | 300C-LR肌肉杠杆系统 | Aurora Scientific | -- |
| 在体成像 | IVIS spectrum CT在体成像系统 | PerkinElmer | 128201 |
| 流式分析 | FACSCanto流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| VSVΔG假型化与转导 | doxycycline诱导浓度与时间、anti-VSV-G中和比例、polybrene浓度、GFP检测时间 阅读提示：Methods中Generation of pseudotyped vesicular stomatitis virus及Functional assessment小节 |
| 慢病毒假型化生产 | HEK293T接种密度、doxycycline 1 μg/ml与100 ng/ml处理顺序、质粒与转染试剂比例、上清收集时间 阅读提示：Methods中Generation of lentivirus pseudotyped with the muscle fusogens小节 |
| 局部肌内注射 | 病毒颗粒数108-109、注射体积25–40 μl、cardiotoxin 35 μl 10 μM及注射间隔、检测时间点 阅读提示：Methods中In vivo viral delivery小节及Figure 2图注 |
| 系统逆行眶后递送 | 给药年龄4周或2周、剂量109与1010、注射次数与间隔、检测组织与时间 阅读提示：Results中免疫逃避与系统递送段落及Figure S5图注 |
| 肌肉病理与功能评估 | EBD剂量0.1 mL/10 g、离心收缩参数、检测时间6个月、统计方法 阅读提示：Methods中Muscle function and membrane integrity analysis小节及Figure 6图注 |