建立Ricca因子生物测定体系
检测木质部可移动的膜去极化介导物。
对叶8叶柄进行烫伤处理，切断烫伤部位并供给待测溶液，在远端叶13叶柄记录表面电位。
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- 移动端
Ricca因子作为电信号传导的可移动蛋白效应物
Ricca's factors as mobile proteinaceous effectors of electrical signaling.
实验完整度
高包含拟南芥突变体、重组蛋白体外活性、昆虫取食、电生理、钙成像、代谢组和蛋白运输等多层功能与机制验证
主要模型
拟南芥Col-0野生型及tgg1 tgg2等突变体 昆虫细胞表达的重组TGG1蛋白 Pieris brassicae幼虫取食叶片模型 GCaMP3表达拟南芥钙成像体系
重点核对
tgg1 tgg2双突变体中昆虫取食诱导的SWP传播显著减弱 重组TGG1蛋白经木质部供给可诱导类似野生型的膜去极化和钙瞬变 TGG1催化活性缺失突变体（E420N/E420A）不能诱导SWP myb28 myb29突变体中TGG1需与脂肪族硫苷共同供给才能诱导SWP 2-PDS体内化学捕获实验表明短寿命苷元中间体参与SWP膜去极化
摘要
β-硫代葡萄糖苷葡萄糖水解酶1和2作为木质部移动因子，在受伤拟南芥的叶脉中产生产生膜去极化的激发子，突出了受伤植物中器官间电信号传导的一种机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 拟南芥叶片间电信号（慢波电位）的化学介导物是什么，以及其如何从受伤叶片传递到远端叶片。
- 核心机制
- TGG1和TGG2经木质部长距离运输，水解脂肪族硫代葡萄糖苷产生短寿命的硫代异羟肟酸-O-硫酸酯（苷元）中间体，触发远端叶片的长时间膜去极化、胞质Ca2+瞬变和茉莉酸信号。
- 主要证据
- tgg1 tgg2双突变体中昆虫取食诱导的SWP和JAZ10表达显著减弱；重组TGG1经木质部供给可诱导野生型样SWP和Ca2+瞬变；myb28 myb29突变体需补充硫苷才能响应TGG1；2-PDS捕获实验抑制TGG1诱导的SWP。
- 研究意义
- 揭示了器官间蛋白质运输在植物电信号传导中的主要作用，确认了Ricca因子假说，并提出了硫苷-黑芥子酶系统产生反应性苷元作为电信号激发子的机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定Ricca因子为TGG蛋白
从叶片提取物中纯化并鉴定诱导SWP的活性成分。
新鲜叶片提取物经阴离子交换色谱和尺寸排阻色谱分级，活性组分进行LC-MS/MS蛋白质组分析。
验证重组TGG1的激发子活性及催化依赖性
确认TGG1单独即可诱导SWP，并检验其酶活性是否必需。
在昆虫细胞中表达重组TGG1及催化失活变体，经亲和纯化后通过Ricca测定法供给植物，记录SWP。
检验TGGs在昆虫诱导SWP中的必要性
确定tgg1 tgg2双突变体对昆虫取食诱导电信号的影响。
将Pieris brassicae幼虫置于叶8，在叶13记录SWP，并检测JAZ10表达。
解析TGGs与GLRs的遗传互作
确定TGG1诱导的SWP和Ca2+瞬变是否依赖GLR3.3和GLR3.6。
在glr3.3、glr3.6单突变体和双突变体及三突变体中供给重组TGG1或L-谷氨酸，记录SWP和Ca2+瞬变。
检测TGGs对胞质Ca2+瞬变的影响
验证TGG1及tgg1 tgg2突变对远端叶片胞质Ca2+瞬变的影响。
使用GCaMP3报告基因植株，供给重组TGG1或进行挤压创伤，在叶13检测GCaMP3荧光变化。
分析脂肪族硫苷降解与SWP的关系
检验脂肪族硫代葡萄糖苷水解是否参与SWP产生。
在创伤叶8后2分钟提取远端叶13主脉，进行HPLC-MS代谢物分析；在myb28 myb29突变体中供给TGG1与硫苷，记录SWP和JAZ10表达。
验证TGG1蛋白在叶间的移动性
确认TGG1蛋白可从叶8运输至远端叶13。
将StrepII-9×His标签的TGG1供给叶8叶柄，5分钟后采集叶13，用抗His抗体进行Western blot检测。
体内化学捕获短寿命苷元中间体
检验硫苷降解产生的短寿命苷元中间体是否参与SWP诱导。
将TGG1与2-PDS共同供给植物，记录SWP并检测JAZ10表达；另将TGG1、葡萄糖莱菔子苷和L-抗坏血酸预孵育后供给植物。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | 抗His6-过氧化物酶抗体 | Sigma-Aldrich | 11965085001 |
| 荧光素示踪 | 异硫氰酸荧光素-葡聚糖（平均分子量3,000-5,000） | Sigma-Aldrich | FD4 |
| 异硫氰酸荧光素-葡聚糖（平均分子量40,000） | Sigma-Aldrich | FD40S | |
| 异硫氰酸荧光素-葡聚糖（平均分子量500,000） | Sigma-Aldrich | FD500S | |
| Ricca因子生物测定 | 葡萄糖莱菔子苷钾盐 | Sigma-Aldrich | PHL89215 |
| 葡萄糖橙皮苷钾盐 | Sigma-Aldrich | PHL85746 | |
| 葡萄糖芸苔素钾盐 | Sigma-Aldrich | PHL80593 | |
| L-谷氨酸 | Sigma-Aldrich | 49449 | |
| L-抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A92902 | |
| 黑芥子苷水合物 | Sigma-Aldrich | 85440 | |
| 荧光素示踪 | 荧光素钠 | Sigma-Aldrich | F6377 |
| 碱性品红 | Sigma-Aldrich | 857343 | |
| 动物实验 | 石蜡油 | Fluka | 76235 |
| Western blot | Pierce™一步转移缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 84731 |
| RT-qPCR | SYBR Green I | Thermo Fisher Scientific | S7563 |
| ROX参比染料 | Thermo Fisher Scientific | 12223012 | |
| M-MLV逆转录酶（RNase H Minus，点突变体） | Promega | M3682 | |
| GoTaq DNA聚合酶 | Promega | M3005 | |
| 蛋白质酶解 | 胰蛋白酶/LysC混合物 | Promega | V5073 |
| 蛋白质纯化 | TEV蛋白酶 | New England Biolabs | P8112S |
| HisTrap excel色谱柱 | Cytiva | 17371205 | |
| Strep-Tactin Superflow高容量色谱柱 | IBA Lifesciences | 2-1209-051 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg色谱柱 | Cytiva | 28989335 | |
| Superdex 75 Increase HiScale 16/40尺寸排阻色谱柱 | Sigma-Aldrich | GE29321907 | |
| 蛋白质分析 | Superdex 200 10/300 GL色谱柱 | Cytiva | 17517501 |
| 蛋白质纯化 | DEAE Sepharose Fast Flow树脂 | Sigma-Aldrich | GE17-0709-01 |
| XK 26/40色谱柱 | Cytiva | 28988949 | |
| 蛋白质浓缩 | Pierce™蛋白浓缩管（PES，3K截留分子量，5-20 mL） | Thermo Fisher Scientific | 88525 |
| Western blot | 硝酸纤维素印迹膜（Amersham Protran 0.45 μm） | Cytiva | 10600062 |
| Western封闭试剂 | Sigma-Aldrich | 11921681001 | |
| Western bright sirius HRP底物 | Advansta | K-12043-C20 | |
| 代谢物分析 | Oasis MCX 96孔板 | Waters | 186000248 |
| 切片制备 | Technovit 7100树脂 | Haslab | 8910005 |
| 样品研磨 | 碳化钨珠 | Qiagen | 69997 |
| 显微操作 | 手动显微操作器 | World Precision Instruments | M3301R |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Ricca因子生物测定 | 叶柄烫伤位置与时间（约5 mm叶柄，沸水100-200 μL，烫伤后3-6小时实验）；供试溶液体积60-70 μL；叶8与叶13的选取；表面电极位置 阅读提示：Methods 'Petiole scalding and Ricca’s factor assay development'；Figure 1A、Figure 3A |
| 重组TGG1蛋白诱导SWP | TGG1浓度1 μM（剂量响应0.5-? μM）；缓冲液50 mM MES pH 6.0（Tris调pH）；供给途径为烫伤叶8叶柄；记录位置为叶13叶柄 阅读提示：Figure 4A-4C；Figure S4D；Methods 'Protein expression and purification from insect cells' |
| 昆虫取食诱导SWP | Pieris brassicae幼虫龄期（4-5龄）、饥饿时间（2小时）、每皿幼虫数（电生理1只，基因表达3只）；取食时间（5-15分钟或至SWP到达叶13）；叶13采样时间（取食后1小时） 阅读提示：Methods 'Pieris brassicae larvae feeding assays'；Figure 4D-4G |
| 硫苷降解代谢物分析 | 创伤后提取主脉时间窗（120秒内）；主脉样本量（10-15 mg，约15株植物）；UPLC-MS/MS参数；相对定量方法 阅读提示：Methods 'Glucosinolate analyses with extracted veins'；Figure 6A-6B |
| 2-PDS体内化学捕获 | 2-PDS浓度1.5 mM；TGG1浓度1 μM；缓冲液50 mM MES pH 6.0；供给途径为烫伤叶8叶柄；JAZ10检测时间（处理后1小时） 阅读提示：Figure 7E-7F；Methods 'Petiole scalding and Ricca’s factor assay development' |