排除细胞周期激酶和Hos1对乙酰化时序的调控
检验Eco1磷酸化或Hos1去乙酰化是否决定黏连蛋白乙酰化的S期特异性
构建Eco1磷酸化位点突变株和Hos1生长素诱导降解株，监测Smc3乙酰化水平及与DNA复制的时序关系
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
姐妹染色单体黏连建立的一个复制叉决定因素
A replication fork determinant for the establishment of sister chromatid cohesion.
实验完整度
高结合酵母体内遗传学实验与纯化蛋白体外生化重建，利用多种DNA底物和突变体进行功能与机制验证
主要模型
酿酒酵母S. cerevisiae细胞 纯化酿酒酵母复制与黏连蛋白体外重建体系 定义结构的DNA底物（带切口、缺口或瓣的环状DNA）
重点核对
Eco1 PIP盒和锌指结构域对复制偶联Smc3乙酰化的必要性 DNA合成后加入黏连蛋白的乙酰化效率 带切口或瓣的DNA底物与共价闭合DNA底物的乙酰化比较 Fen1和Cdc9连接酶对乙酰化反应的终止作用 Scc2-Scc4和Pds5对Smc3乙酰化的贡献
摘要
伴随DNA复制，染色体黏连蛋白复合物在新复制的姐妹染色单体之间建立黏连。黏连建立需要Eco1乙酰转移酶对黏连蛋白保守赖氨酸残基的乙酰化。本文探讨黏连蛋白乙酰化如何与DNA复制相关联。复制偶联黏连蛋白乙酰化的生化重建显示，DNA复制过程中形成的瞬时DNA结构控制乙酰化反应。随着聚合酶完成滞后链复制，链置换合成产生DNA瓣，这些瓣被修剪形成带切口的双链DNA。DNA瓣和切口均刺激黏连蛋白乙酰化，而随后的切口连接以完成冈崎片段成熟则终止乙酰化反应。带瓣或切口的DNA底物构成瞬时分子线索，将黏连蛋白乙酰化导向复制叉后方的一个窗口，紧邻黏连蛋白可能包埋两条姐妹染色单体的位置。我们的结果解释了DNA复制如何与姐妹染色单体黏连建立相关联。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DNA复制如何与黏连蛋白Eco1乙酰化及姐妹染色单体黏连建立相偶联？
- 核心机制
- DNA复制过程中冈崎片段成熟产生的瞬时DNA瓣和切口刺激Eco1对Smc3的乙酰化，而切口连接形成共价闭合DNA后终止该乙酰化反应。
- 主要证据
- 利用纯化酵母复制蛋白和黏连蛋白建立体外复制偶联乙酰化体系，结合多种定义结构的DNA底物、Eco1突变体以及Fen1和Cdc9，证明DNA瓣和切口促进乙酰化，连接则终止乙酰化；酵母体内实验支持该机制。
- 研究意义
- 提出了姐妹染色单体黏连建立在DNA复制叉处时空偶联的模型，解释了DNA复制如何与黏连建立相关联。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
复制偶联黏连蛋白乙酰化的生化重建
在纯化体系中重建依赖DNA复制的Smc3乙酰化
以引物退火的环状单链DNA为模板，加入PCNA、RFC、Ctf18-RFC、RPA、DNA聚合酶δ或ε、黏连蛋白、Scc2-Scc4、Pds5和Eco1进行引物延伸反应，检测Smc3乙酰化
确定乙酰化与DNA合成时间的关系
判断乙酰化是否需要持续DNA合成或仅需复制产物
在Pol ε介导的引物延伸完成后加入黏连蛋白，比较DNA合成期间与合成后加入时的乙酰化效率；并逐一省略反应组分
利用定义结构的DNA底物鉴定促进乙酰化的结构
确定复制产物中何种DNA结构刺激黏连蛋白乙酰化
制备部分复制、完全复制、带切口、带缺口、带瓣及共价闭合的DNA底物，加载PCNA后加入黏连蛋白和辅因子，检测Smc3乙酰化
检验冈崎片段成熟连接对乙酰化的终止作用
验证切口连接是否终止黏连蛋白乙酰化
在Pol δ催化的引物延伸反应中加入Fen1和Cdc9或T4 DNA ligase，分析复制产物连接情况及Smc3乙酰化
分析黏连蛋白 loader和Pds5对乙酰化的贡献
确定Scc2-Scc4和Pds5在复制偶联乙酰化中的作用
在复制偶联乙酰化反应中分别或同时省略Scc2-Scc4和Pds5，或使用Scc4-Scc2N与Scc2C模块，检测Smc3乙酰化及PCNA结合
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫印迹 | 小鼠单克隆抗V5(Pk)抗体 | Bio-Rad | MCA1360 |
| 小鼠单克隆抗HA抗体(F-7) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7392 | |
| 小鼠单克隆抗myc抗体(9E10) | Bio-Rad | MCA2200 | |
| 蛋白纯化 | 兔IgG-琼脂糖 | Merck | A2909 |
| TALON金属亲和树脂 | Clontech Laboratories | 635502 | |
| HiTrap肝素HP 1ml柱 | Cytiva | 17-0407-01 | |
| HiTrap SP HP 1ml柱 | Cytiva | 29-0513-24 | |
| Superose 6 Increase 10/300 GL凝胶过滤柱 | Cytiva | 29-0915-96 | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL凝胶过滤柱 | Cytiva | 28-9909-44 | |
| Superdex 75 10/300 GL凝胶过滤柱 | Cytiva | 17-5174-01 | |
| cOmplete无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Merck | 04693132001 | |
| Pefabloc SC蛋白酶抑制剂 | Roche | 11429876001 | |
| DNA检测 | SYBR Gold核酸凝胶染料 | ThermoFisher | S11494 |
| 乙酰化反应 | 乙酰辅酶A锂盐 | Merck | A2181 |
| DNA固定 | Dynabeads M-280链霉亲和素磁珠 | ThermoFisher | 11206D |
| DNA纯化 | MicroSpin S-400 HR柱 | Cytiva | 27514001 |
| DNA底物制备 | T7 DNA聚合酶（未修饰） | NEB | M0274 |
| DNA连接 | T4 DNA连接酶 | Promega | M180B |
| DNA底物制备 | Nb.BssSI切口酶 | NEB | R0681 |
| Nt.BbvCI切口酶 | NEB | R0632 | |
| 核酸外切酶III | ThermoFisher | EN0191 | |
| T5核酸外切酶 | NEB | M0663 | |
| 乙酰化反应 | ATP | ThermoFisher | R0441 |
| 蛋白纯化 | TCEP | Fluorochem Limited | M02624 |
| 酵母细胞处理 | 3-吲哚乙酸（生长素） | Merck | I2886 |
| DNA去蛋白 | 蛋白酶K | ThermoFisher | EO0491 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 复制偶联黏连蛋白乙酰化反应 | 反应组分浓度：4 nM ssDNA、400 nM RPA、70 nM PCNA、60 nM RFC和60 nM Ctf18-RFC、150 nM cohesin、150 nM Scc2-Scc4、150 nM Pds5、35或70 nM Eco1；20 nM Pol ε或4 nM Pol δ；30 °C孵育12分钟 阅读提示：Methods：Replication-coupled cohesin acetylation assay |
| 定义结构DNA底物的乙酰化实验 | DNA底物类型（部分复制、完全复制、带切口、带63或213 nt缺口、带10 nt瓣、共价闭合）及PCNA加载条件（20 nM Rfc1-RFC或120 nM Ctf18-RFC）；30 °C孵育20分钟 阅读提示：Methods：Cohesin acetylation following direct PCNA loading onto immobilized DNA，以及Figure 5图注 |
| 冈崎片段成熟与连接实验 | 10 nM Pol δ、35 nM Fen1、140 nM Cdc9或0.14 U/ml T4 DNA ligase；反应15分钟后加入Eco1继续20分钟 阅读提示：Methods：Replication maturation and ligation assays，以及Figure 6图注 |
| 酵母体内乙酰化监测 | α因子同步G1；释放后8 mg/mL nocodazole和auxin处理2小时；Eco1突变位点Swe1 Y164A、DDK S98A-S104A、CDK S67A-T94A-S99A-S105A 阅读提示：Experimental Model and Subject Details：Yeast strains，以及Figure 1图注 |
| Eco1和Hos1降解实验 | 500 mM indole-3-acetic acid（auxin）用于降解aid标记蛋白；Hos1降解实验中2%半乳糖诱导Eco1过表达 阅读提示：Experimental Model and Subject Details：Yeast strains |