SELEX筛选靶向ncOGT与β-catenin的RNA适配体
获得分别结合ncOGT（非催化TPR结构域）和β-catenin、且不抑制酶活性的RNA适配体。
在全长ncOGT与其TPR结构域之间切换靶标进行11轮SELEX；对β-catenin进行5轮和8轮文库的NGS分析，筛选富集序列T1和bc339。
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双特异性RNA适配体实现对靶标特异性O-GlcNAcylation的操控并揭示β-catenin上O-GlcNAc的功能
Dual-specificity RNA aptamers enable manipulation of target-specific O-GlcNAcylation and unveil functions of O-GlcNAc on β-catenin.
实验完整度
高含SELEX筛选、SPR/RNA-IP结合验证、细胞IP-WB、PLA、Co-IP、CUT&RUN、RNA-seq及TOPFlash等多层级功能与机制验证
主要模型
HEK293T细胞系 表达GFP-β-catenin等GFP标签蛋白的HEK293T细胞 稳定表达适配体的HEK293T细胞系 Wnt3A条件培养基处理的HEK293T细胞
重点核对
适配体与底物质粒共转染比例（如GFP-β-catenin 0.1 μg与各适配体质粒1 μg/10 cm皿） Ac5S处理浓度与时间（50 μM，20 hr）及TMG（2 μM，6 hr） Wnt3A条件培养基刺激条件（50% v/v，4 hr） IP-WB中O-GlcNAc信号归一化到对应蛋白条带 PLA斑点数归一化到细胞核数，N值见图注
摘要
O-GlcNAc是一种调控蛋白质功能的动态翻译后修饰（PTM）。在研究O-GlcNAc的调控作用时，一个主要障碍是无法一次改变单个蛋白质上的O-GlcNAcylation。本文中，我们开发了一种基于双RNA适配体的方法，同时靶向O-GlcNAc转移酶（OGT）和β-catenin（Wnt信号通路的关键转录因子），以选择性提高后者的O-GlcNAcylation而不影响其他OGT底物。利用OGT/β-catenin双特异性适配体，我们发现β-catenin的O-GlcNAcylation通过抑制其与β-TrCP的相互作用而稳定该蛋白。O-GlcNAc还增加β-catenin与EZH2的相互作用，将EZH2招募到启动子并显著改变转录组。此外，通过将核糖开关或诱导型表达系统与适配体偶联，我们实现了对蛋白质特异性O-GlcNAcylation的诱导型调控。总之，我们的发现证明了双特异性适配体在调控单个蛋白质O-GlcNAcylation方面的有效性和多功能性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何在不影响其他OGT底物的情况下改变单个蛋白质（β-catenin）的O-GlcNAcylation，并研究该修饰对β-catenin功能的调控作用。
- 核心机制
- 双特异性RNA适配体通过诱导OGT与β-catenin的空间邻近，选择性增加β-catenin的O-GlcNAcylation；该修饰抑制β-catenin与β-TrCP的相互作用从而稳定蛋白，并增强其与EZH2的相互作用、将EZH2招募至启动子，以Wnt依赖方式改变转录组。
- 主要证据
- 通过SELEX获得靶向ncOGT的非抑制性适配体T1和靶向β-catenin的适配体bc339；IP-WB和质谱迁移实验显示DS适配体使GFP-β-catenin及内源β-catenin的O-GlcNAc升高2–15倍；PLA和Co-IP显示β-catenin与β-TrCP互作受抑、与EZH2互作增强；CUT&RUN显示EZH2启动子结合位点增加；RNA-seq显示Wnt缺失时激活83个基因、Wnt激活时抑制85个基因。
- 研究意义
- 作者提出双特异性适配体是研究单个蛋白质O-GlcNAcylation及其功能的多功能工具，其模块化特性可拓展至其他PTM调控、促进蛋白复合物形成及诱导蛋白与细胞器邻近。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证适配体结合亲和力与不抑制OGT活性
确认T1与bc339对靶蛋白的结合能力，并检验T1是否抑制OGT酶活性。
放射性点杂交、SPR测定Kd及结合动力学；UDP-Glo测定OGT活性；RNA-IP验证细胞内T1与OGT结合；WB检测全局O-GlcNAcylation；ActD脉冲追踪测定适配体半衰期。
构建双特异性适配体并优化连接区
将T1与靶蛋白适配体连接，实现对GFP标签蛋白及内源β-catenin的特异性O-GlcNAcylation。
设计柔性单链连接区（NL1F、NL8F系列）及基于三向/四向RNA连接的结构化连接区（3JB1F、4JC1RR、3JB8F）；通过IP-WB和质谱迁移实验检测O-GlcNAc水平。
验证O-GlcNAc对β-catenin稳定性及与β-TrCP互作的影响
检验O-GlcNAc是否通过影响β-catenin与β-TrCP的相互作用来调控其稳定性。
PLA检测GFP-β-catenin与β-TrCP邻近；WB检测β-catenin总丰度及Ser33/37/Thr41/Ser45位点磷酸化；Ac5S处理验证OGT依赖性。
验证O-GlcNAc对β-catenin与表观修饰因子互作及转录活性的影响
研究O-GlcNAc如何调控β-catenin与EZH2、KAT2A、EP300、KAT5等互作及其转录活性。
PLA和Co-IP检测β-catenin与EZH2、KAT2A、EP300、KAT5及H3K27me3、H3K9ac的邻近；TOPFlash/FOPFlash报告基因检测Wnt响应转录活性。
CUT&RUN与RNA-seq分析EZH2启动子结合及转录组变化
确定O-GlcNAc是否将EZH2招募至启动子并改变基因表达谱。
对表达对照或3JB8F+12适配体的HEK293T细胞在±Wnt条件下进行CUT&RUN测序（EZH2抗体）和RNA-seq；用shβ-catenin、shEZH2及Ac5S处理验证依赖性。
构建可诱导调控的双特异性适配体
验证通过核糖开关或Tet-On系统对双特异性适配体功能进行可诱导调控的可行性。
将Mango核糖开关元件整合入NL1F50构建LRS1F50C，用TO1触发失活；构建U6TO驱动atdT1、U6WT驱动3JB8F+12的Tet-On系统，用Dox诱导失活。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
筛选与验证适配体结合特征
验证转录活性与转录组变化
评估适配体细胞内稳定性与定位
测定酶活性
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与转染 | TransIT-X2转染试剂 | Mirus Bio | MIR 6000 |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco | 10567014 |
| 胎牛血清 | Gibco | 16140071 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140163 | |
| 稳定细胞系筛选 | 潮霉素B | Gibco | 10687010 |
| 细胞传代 | TrypLE Express酶 | Gibco | 12604013 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| 逆转录 | SuperScript IV逆转录酶 | Invitrogen | 18090010 |
| qPCR | TaqMan Fast Advanced预混液 | Applied Biosystems | 4444557 |
| 质粒构建 | Q5高保真DNA聚合酶 | New England BioLabs | M0491 |
| In-Fusion HD克隆试剂盒 | TaKaRa Bio | 638909 | |
| TOPO TA测序克隆试剂盒 | Invitrogen | 450030 | |
| 质粒纯化 | Purelink快速低内毒素中量质粒纯化试剂盒 | Invitrogen | A35892 |
| SELEX | T4多核苷酸激酶 | New England BioLabs | M0201 |
| [γ−32P]-ATP | American Radiolabeled Chemicals | ARP 0102F-250 μCi | |
| 南极磷酸酶 | New England BioLabs | M0289 | |
| 酵母tRNA | Invitrogen | AM7119 | |
| 蛋白纯化 | 镍-次氮基三乙酸琼脂糖 | Qiagen | 30210 |
| Pierce谷胱甘肽琼脂糖珠 | Thermo Scientific | 16100 | |
| PreScission蛋白酶 | GenScript | Z02799 | |
| 蛋白定量 | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23227 |
| OGT活性检测 | UDP-Glo糖基转移酶活性检测试剂盒 | Promega | V6971 |
| CKII肽（PGGSTPVSSANMM） | JHMI Synthesis & Sequencing Facility | -- | |
| 免疫沉淀 | Pierce蛋白A/G磁珠 | Thermo Scientific | 88802 |
| GFP-Trap磁性琼脂糖 | ProteinTech | gtma-10 | |
| 抗β-catenin抗体（克隆14） | BD Biosciences | 610153 | |
| Western blot | 抗O-GlcNAc IgM抗体（CTD110.6） | Produced in the lab | -- |
| 抗OGT抗体（AL28） | Produced in the lab | -- | |
| 抗β-tubulin抗体 | Cell Signaling Technology | 2146 | |
| SuperSignal West Femto ECL底物 | Thermo Scientific | 34095 | |
| NuPAGE 4–12% Bis-Tris中量蛋白胶 | Invitrogen | WG1402BOX | |
| Amersham Hybond P 0.2 PVDF膜 | GE Healthcare/Cytiva | 10600021 | |
| 质谱迁移实验 | UDP-GalNAz | Chemily | SN02012 |
| DBCO-NHS酯 | Click Chemistry Tools | A133 | |
| 氨基-dPEG12-Tris | Quanta BioDesign | 10482 | |
| PLA | Duolink PLA试剂 | Sigma-Aldrich | DUO92001, DUO92005, DUO92013, DUO82049 |
| AlexaFluor 488鬼笔环肽 | Invitrogen | R37110 | |
| 含NucBlue染料的ProLong Glass抗淬灭封片剂 | Invitrogen | P36985 | |
| CUT&RUN | CUTANA ChIC/CUT&RUN试剂盒 | EpiCypher | 14-1048 |
| NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒 | New England BioLabs | E7103L | |
| Qubit 1X dsDNA HS检测试剂盒 | Invitrogen | Q33230 | |
| 报告基因实验 | Nano-Glo双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | N1610 |
| 细胞处理 | Ac4-5SGlcNAc | -- | -- |
| Thiamet-G | -- | -- | |
| 核糖开关诱导 | TO1-3PEG-生物素 | Applied Biological Materials (abm) | G955 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 适配体转染与O-GlcNAcylation检测 | GFP-β-catenin 0.1 μg与各适配体质粒1 μg/10 cm皿共转染；内源β-catenin靶向时每皿转染1.5 μg质粒；Ac5S 50 μM处理20 hr、TMG 2 μM处理6 hr 阅读提示：STAR Methods中Cell Culture and Transfection小节及Figure 2图注 |
| Wnt刺激条件 | Wnt3A条件培养基以50%（v/v）加入，处理4 hr 阅读提示：STAR Methods中Cell Culture and Transfection及Production of Wnt3A-Conditioned Medium小节 |
| PLA检测 | 每孔1.0×10^4细胞、19.7 ng适配体质粒/孔；PLA斑点数归一化到细胞核数，N=8或10；所用一抗稀释比 阅读提示：STAR Methods中Proximity Ligation Assay (PLA)小节及各Figure 3–6图注 |
| CUT&RUN | 每反应5.0×10^5细胞、EZH2抗体500 ng、E.coli基因组DNA 0.5 ng spike-in校准；差异结合分析参数 阅读提示：STAR Methods中CUT&RUN Sequencing and Data Analysis小节及Figure 6图注 |
| RNA-seq与TOPFlash | RNA-seq测序平台为Illumina HiSeq 4000 2×150 bp；TOPFlash各质粒转染量与时间见表S3；以NanoLuc归一化后再对FOPFlash归一化 阅读提示：STAR Methods中RNA Sequencing and Data Analysis与TOPFlash/FOPFlash小节及Table S3 |
| 核糖开关/Tet-On诱导调控 | TO1处理浓度存在差异：图注为750 μM，方法部分为750 nM处理8 hr；Dox处理条件及对照溶剂 阅读提示：Figure 7图注与STAR Methods中Cell Culture and Transfection、Design of Riboswitch Elements小节 |