疾病相关SHP2突变体在细胞中形成点状聚集
验证疾病相关SHP2突变体是否在细胞内形成离散的点状结构。
在KYSE520、HEK293T、A549、HUVEC等细胞中稳定表达mEGFP或mScarlet标记的SHP2 WT及突变体，用活细胞荧光显微镜观察点状聚集；并在Ptpn11D61G/+和Ptpn11E76K/+小鼠来源的MEF、MSC以及NS患者口腔黏膜上皮细胞中进行免疫荧光检测。
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疾病相关SHP2突变体的相分离导致MAPK过度激活
Phase Separation of Disease-Associated SHP2 Mutants Underlies MAPK Hyperactivation.
实验完整度
高包含体外重组蛋白LLPS实验、多种细胞系及小鼠原代细胞、患者样本，并有FRAP、突变体功能验证及机制验证
主要模型
KYSE520细胞系 HEK293T细胞系 Ptpn11D61G/+和Ptpn11E76K/+小鼠来源的MEF和MSC Noonan综合征患者口腔黏膜上皮细胞
重点核对
SHP2突变体（D61G、E76A、E76K、Y279C、R498L）在KYSE520等细胞中形成点状聚集，野生型SHP2不形成 通过FRAP实验验证SHP2突变体点状聚集的液体样流动性，荧光恢复时间在数分钟内 体外重组SHP2蛋白在含10%(w/v) PEG3350的缓冲液中形成液滴，突变体所需临界浓度低于野生型 SHP099或ET070处理可剂量依赖性减弱SHP2突变体的LLPS和细胞内点状聚集 R362E/K364E突变消除SHP2突变体在细胞内的点状形成，但不影响PTP活性
摘要
由PTPN11编码的非受体蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）SHP2在正常发育过程中的RAS-MAPK信号传导中起重要作用。令人困惑的是，为什么PTPN11中的酶激活突变和失活突变都会导致具有重叠临床表现的人类发育障碍。在这里，我们揭示了这些疾病相关SHP2突变体共有的一种常见液-液相分离（LLPS）行为。SHP2 LLPS由保守的折叠良好的PTP结构域通过多价静电相互作用介导，并通过构象变化受内在自抑制机制调节。SHP2变构抑制剂可以减弱SHP2突变体的LLPS，从而增强SHP2 PTP活性。此外，疾病相关SHP2突变体可以在LLPS中招募并激活WT SHP2，以促进MAPK激活。这些结果不仅表明LLPS作为一种功能获得机制参与SHP2相关人类疾病的发病机制，而且提供证据表明PTP可能受LLPS调节，并可作为治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 为什么PTPN11的酶激活突变和失活突变都会导致具有重叠临床表现的发育障碍，以及SHP2突变体如何激活RAS-MAPK信号。
- 核心机制
- 疾病相关SHP2突变体通过PTP结构域的多价静电相互作用获得液-液相分离能力，该能力受SHP2从闭合到开放构象转变的调节；NS-ML突变体通过相分离招募并激活野生型SHP2，从而促进ERK1/2过度激活。
- 主要证据
- 在多种细胞系、小鼠原代细胞和患者细胞中观察到SHP2突变体形成点状聚集；体外重组蛋白液滴实验、FRAP和相图分析证实LLPS；R362E/K364E突变破坏LLPS并减弱ERK1/2激活；WT和NS-ML突变体共表达协同增强pERK1/2水平。
- 研究意义
- 揭示LLPS作为一种功能获得机制参与SHP2相关人类疾病的发病机制，为治疗SHP2相关发育障碍提供了靶向LLPS的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SHP2突变体点状聚集的液体样性质验证
验证SHP2突变体点状聚集是否具有液-液相分离的液体样特征。
通过活细胞成像观察点状聚集的融合现象，并利用荧光漂白恢复（FRAP）实验检测荧光恢复动力学；同时利用CRISPR-Cpf1对内源性SHP2N58S进行mEGFP标签敲入，验证内源性突变体点状聚集的流动性。
体外重组SHP2蛋白的LLPS能力分析
验证SHP2突变体是否在体外具有更强的液-液相分离能力。
纯化重组SHP2 WT及多种突变体蛋白，在含PEG3350的缓冲液中观察液滴形成，测定浊度OD600，并进行FRAP实验和相图分析。
构象变化对SHP2 LLPS的调控验证
验证SHP2从闭合到开放构象的转变是否促进LLPS。
使用SHP2变构抑制剂SHP099和ET070锁定SHP2于闭合构象，检测其对体外液滴形成和细胞内点状聚集的影响；利用smFRET检测SHP099对SHP2E76A构象的影响；并使用2P-IRS-1肽段促进开放构象，检测其对LLPS的影响。
PTP结构域驱动SHP2 LLPS的静电相互作用机制解析
确定介导SHP2 LLPS的结构域和关键电荷斑块。
纯化全长SHP2及截短体（SHP2ΔC、N/C-SH2、SHP2-PTP），比较液滴形成能力；构建17个PTP结构域表面电荷突变体，筛选影响LLPS的关键斑块；并在疾病相关SHP2突变体中引入R362E/K364E突变，检测细胞内点状形成。
LLPS对SHP2磷酸酶活性的影响及ERK1/2激活验证
验证LLPS是否增强SHP2 PTP活性，以及LLPS是否为SHP2突变体诱导ERK1/2过度激活所必需。
在LLPS条件和溶液条件下使用pNPP或DiFMUP底物测定SHP2 WT及突变体的磷酸酶活性；在HEK293T细胞中稳定表达SHP2 WT及突变体，用免疫印迹检测pMEK1/2和pERK1/2水平；引入LLPS缺陷型R362E/K364E突变，检测其对ERK1/2激活的影响。
NS-ML突变体通过LLPS招募并激活WT SHP2促进ERK1/2激活
验证NS-ML突变体是否通过相分离招募WT SHP2并协同增强ERK1/2激活。
在HEK293T细胞中共转染不同比例的SHP2WT和SHP2Y279C质粒，检测pERK1/2水平；在KYSE520细胞中共表达SHP2WT-mEGFP和SHP2R498L-mScarlet，观察共定位；体外混合WT和NS-ML突变体蛋白，检测液滴中WT的分布及混合液滴的磷酸酶活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | SH-PTP2(B-1)抗体 | Santa Cruz | sc-7834 |
| 磷酸化p44/p42 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)抗体 | Cell Signaling Technology | 4370S | |
| p44/p42 MAPK(Erk1/2)抗体 | Cell Signaling Technology | 9102S | |
| 磷酸化MEK1/2(Ser217/221)(41G9)抗体 | Cell Signaling Technology | 9154 | |
| MEK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9122 | |
| SHP2抗体 | Cell Signaling Technology | 3397T | |
| HA抗体 | Cell Signaling Technology | 2367S | |
| FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118S | |
| α-微管蛋白抗体 | Abcam | ab52866 | |
| 体外LLPS实验 | 聚乙二醇3350 | Sigma | -- |
| 磷酸酶活性测定 | 6,8-二氟-4-甲基伞形酮磷酸酯 | Invitrogen | D22065 |
| 细胞培养 | 多西环素盐酸盐 | Yeasen | 60204ES08 |
| G418硫酸盐 | Yeasen | 60220ES03 | |
| 细胞存活实验 | CellTiter-Glo试剂 | Promega | G7570 |
| 质粒转染 | Polyjet转染试剂 | SignaGen | SL100688 |
| 细胞培养 | 内皮细胞生长培养基 | Promocell | C-22010 |
| 蛋白纯化 | HisTrap HP螯合柱 | GE healthcare | -- |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg色谱柱 | GE Healthcare | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞点状聚集观察 | 细胞系（KYSE520、HEK293T等）、SHP2变体（WT、D61G、E76A、E76K、Y279C、R498L）、表达水平需与内源性SHP2相当、成像条件（Leica TCS SP8，100倍油镜，37°C） 阅读提示：Results 'Disease-associated SHP2 mutants form discrete puncta in cells'及Figure 1图注；Methods 'Live cell imaging' |
| FRAP实验 | 激光波长488 nm、 bleaching区域（圆形ROI）、激光功率100%、荧光恢复采集时间间隔、数据分析方法（Fiji，背景扣除） 阅读提示：Methods 'Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)'；Figure 2及S2图注 |
| 体外LLPS液滴形成 | 蛋白浓度8 μM、缓冲液组成（20 mM Tris pH 8.0，10%(w/v) PEG3350）、NaCl浓度、孵育温度和时间（37°C，120 min）、浊度测定参数（OD600，37°C，10小时） 阅读提示：Methods 'In vitro liquid-liquid phase separation (LLPS) assay'；Figure 3图注 |
| 相图分析 | 蛋白浓度范围0.125–8 μM、NaCl浓度范围50–500 mM、缓冲液pH 8.0、PEG3350浓度10%(w/v)、孵育条件37°C 120 min 阅读提示：Methods 'In vitro liquid-liquid phase separation (LLPS) assay'；Figure 3F图注 |
| 变构抑制剂处理 | SHP099或ET070浓度（体外20/50 μM，细胞10 μM）、处理时间（体外15 min，细胞成像每15 min）、对照（DMSO） 阅读提示：Methods 'In vitro liquid-liquid phase separation (LLPS) assay'及'Live cell imaging'；Figure 4图注 |
| 磷酸酶活性测定 | 底物（pNPP 20 mM或DiFMUP 5 ng/μL酶）、缓冲液组成（60 mM HEPES pH 7.2，75 mM NaCl，75 mM KCl，1 mM EDTA）、检测波长（DiFMUP Ex/Em 358/455；pNPP OD405）、反应时间 阅读提示：Methods 'In vitro SHP2 phosphatase assay'；Figure 6D、6E图注 |
| WT和NS-ML突变体共表达 | 质粒转染比例（1:1或梯度）、细胞系（HEK293T或SHP2 KO HEK293T）、检测时间（转染后48小时）、pERK1/2检测方法（Western blot） 阅读提示：Results 'LLPS of NS-ML SHP2 mutants recruit and activate SHP2WT to promote ERK1/2 activation'及Figure 7图注；Methods 'Plasmids Transfection and viral infection' |
| 内源性SHP2蛋白浓度测定 | 细胞系（A549、HEK293T、KYSE520）、裂解缓冲液（WB/IP lysis buffer含蛋白酶抑制剂）、标准曲线（纯化SHP2WT蛋白3–0.063 μM）、体积校准系数（0.74） 阅读提示：Methods 'Estimation of endogenous SHP2 protein concentrations'；Figure S3F图注 |