病毒扩增与RNA提取
获得SARS-CoV-2感染的细胞总RNA用于测序分析
Vero细胞以MOI 0.05感染BetaCoV/Korea/KCDC03/2020，37°C、5% CO2培养，感染后24小时收获，TRIzol提取总RNA，DNase I处理并柱纯化
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SARS-CoV-2转录组的结构
The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome.
实验完整度
中体外细胞感染模型结合两种测序技术，无动物模型或独立功能验证；机制推测为主
主要模型
SARS-CoV-2感染的Vero细胞（BetaCoV/Korea/KCDC03/2020，MOI 0.05，感染后24小时） 体外转录（IVT）病毒序列RNA作为未修饰阴性对照
重点核对
Vero细胞感染SARS-CoV-2 BetaCoV/Korea/KCDC03/2020，MOI 0.05，感染后24小时收获 纳米孔DRS使用SQK-RNA002试剂盒，FLO-MIN106D流动池，MinION测序42小时 DNB-seq使用MGIEasy RNA定向文库，DNBSEQ-G50RS测序（PE100） RT-PCR验证非经典融合转录本，以未感染Vero细胞cDNA为阴性对照 修饰检测以IVT未修饰RNA为对照，修改位点阈值>20%频率
摘要
SARS-CoV-2是导致COVID-19大流行的β冠状病毒。尽管SARS-CoV-2基因组近期已被报道，但其转录组结构尚不清楚。利用两种互补的测序技术，我们呈现了SARS-CoV-2转录组和表观转录组的高分辨率图谱。DNA纳米球测序显示，由于众多不连续转录事件，转录组高度复杂。除经典基因组RNA和9种亚基因组RNA外，SARS-CoV-2还产生编码未知ORF的转录本，这些转录本具有融合、缺失和/或移码。利用纳米孔直接RNA测序，我们进一步在病毒转录本上发现至少41个RNA修饰位点，最常见的基序为AAGAA。修饰RNA的poly(A)尾比未修饰RNA更短，提示修饰与3′尾之间存在联系。对本研究发现未知转录本和RNA修饰的功能研究将为理解SARS-CoV-2生命周期和致病性开辟新方向。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARS-CoV-2的转录组和表观转录组结构如何，是否存在未知的转录本和RNA修饰？
- 核心机制
- SARS-CoV-2通过经典TRS介导的不连续转录产生gRNA和9种sgRNA，同时存在TRS-L依赖的非经典融合、TRS-L非依赖的长距离融合和局部融合等多种RNA连接事件；病毒RNA携带至少41个RNA修饰位点（常见基序AAGAA），修饰RNA的poly(A)尾更短。
- 主要证据
- 纳米孔DRS（879,679 reads）和DNB-seq（305,065,029 reads）测序数据支持9种经典sgRNA及gRNA表达，ORF10无表达证据；RT-PCR验证部分非经典融合转录本；以IVT未修饰RNA为对照鉴定41个潜在修饰位点；poly(A)尾长度分析显示修饰RNA尾更短（Mann-Whitney U检验，p < 9.8 × 10−5和p < 7.3 × 10−12）。
- 研究意义
- 为SARS-CoV-2病毒蛋白功能、复制机制及致病性相关宿主-病毒相互作用研究提供基础，揭示的未知ORF和RNA修饰可能参与病毒存活和免疫逃逸，为后续研究开辟新方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
纳米孔直接RNA测序（DRS）
获得长读长病毒转录本并检测RNA修饰和poly(A)尾
取4 μg DNase I处理的总RNA，按SQK-RNA002建库，加SUPERase-In，用SuperScript IV逆转录并延长2小时，FLO-MIN106D流动池，MinION测序42小时
DNA纳米球测序（DNB-seq）
验证sgRNA及其连接位点并定量融合频率
取1 μg总RNA，Dynabeads富集poly(A)+ RNA，MGIEasy RNA定向文库构建，MGISEQ-200RS流动池，DNBSEQ-G50RS测序（PE100）
体外转录未修饰RNA对照制备
作为RNA修饰检测的阴性对照
以感染细胞总RNA逆转录后PCR扩增病毒序列，T7体外转录制备约2.3 kb或4.4 kb的部分重叠RNA片段，覆盖全基因组
RT-PCR验证非经典融合转录本
验证测序发现的sgRNA及其负链对应物
以感染和未感染Vero细胞总RNA逆转录，使用正链和负链特异性引物，6 ng/μl放线菌素D，PCR后琼脂糖凝胶电泳
RNA修饰与poly(A)尾分析
鉴定病毒RNA修饰位点并分析修饰与poly(A)尾长度的关系
用tombo 1.5的model_sample_compare模式比较病毒RNA与IVT对照的离子电流信号，用poreplex 0.5.0测量poly(A)尾长度
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 病毒扩增与细胞培养 | DMEM培养基 | GIBCO | 11995065 |
| 胎牛血清 | GIBCO | 10082147 | |
| 青霉素-链霉素 | GIBCO | 15140163 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| 重组DNase I（无RNase） | Takara | 2270A | |
| RNeasy MinElute纯化试剂盒 | QIAGEN | 74204 | |
| 逆转录与PCR | SuperScript IV逆转录酶 | Invitrogen | 18090200 |
| Q5高保真2X预混液 | NEB | M0492L | |
| 凝胶回收 | 凝胶回收试剂盒 | Labopass | CMG0112 |
| 体外转录 | MEGAscript T7转录试剂盒 | Invitrogen | AMB13345 |
| RNA纯化 | 寡核苷酸纯化浓缩试剂盒 | Zymo Research | D4061 |
| 凝胶电泳 | 1 Kb Plus DNA分子量标准 | Invitrogen | 10787026 |
| 纳米孔直接RNA测序 | 直接RNA测序试剂盒 | Oxford Nanopore Technologies | SQK-RNA002 |
| SUPERase•In RNase抑制剂 | Invitrogen | AM2696 | |
| R9.4.1流动池 | Oxford Nanopore Technologies | FLO-MIN106D | |
| MinION测序仪 | Oxford Nanopore Technologies | MinION; RRID: SCR_017985 | |
| DNB-seq文库构建 | Dynabeads mRNA纯化试剂盒 | Invitrogen | 61006 |
| MGIEasy RNA定向文库构建试剂盒 | MGI | 1000006385 | |
| DNB-seq测序 | MGISEQ-200RS高通量测序试剂盒（PE100） | MGI | 1000005233 |
| MGISEQ-200RS测序流动池 | MGI | 1000003794 | |
| DNBSEQ-G50RS测序仪 | MGI | DNBSEQ-G50RS |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒扩增与感染 | Vero细胞（ATCC CCL-81）感染BetaCoV/Korea/KCDC03/2020，MOI 0.05，感染后24小时收获，为第四代病毒且未噬菌斑纯化 阅读提示：Experimental Model and Subject Details |
| 纳米孔直接RNA测序 | 4 μg总RNA，SQK-RNA002建库，反转录替换为SuperScript IV并延长2小时，加20 U SUPERase-In，MinION测序42小时 阅读提示：STAR★Methods中Nanopore direct RNA sequencing小节 |
| DNB-seq | 1 μg总RNA，Dynabeads富集poly(A)+ RNA，250 bp插入文库，DNBSEQ-G50RS PE100测序 阅读提示：STAR★Methods中DNBseq RNA sequencing小节 |
| RNA修饰检测 | 以IVT未修饰RNA为对照，修饰位点阈值>20%频率，tombo 1.5 model_sample_compare模式，IVT reads降采样至每片段约10,000 reads 阅读提示：STAR★Methods中Balancing IVT product reads and modified base detection小节及Figure S4 |
| poly(A)尾分析 | poreplex 0.5.0测量，以30 nt poly(A)校准对照换算长度，高度修饰位点为8个位点中至少3个修饰且统计量<0.01 阅读提示：STAR★Methods中Poly(A) length distribution analysis及Poly(A) length analysis depending on modification rates小节 |
| RT-PCR验证 | 0.25 μg总RNA，6 ng/μl放线菌素D，正链和负链特异性逆转录，未感染Vero细胞cDNA为阴性对照 阅读提示：STAR★Methods中Reverse transcription and PCR小节及Figure S3 |