前脂肪细胞纤毛的体外和体内特征鉴定
确认前脂肪细胞在体外和体内是否具有初级纤毛，并定位其组织分布。
免疫荧光染色3T3-L1细胞、小鼠和人原代前脂肪细胞；使用cilia glow小鼠全组织成像观察附睾白色脂肪组织中纤毛化血管周围细胞；BrdU掺入评估HFD激活。
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Omega-3脂肪酸激活纤毛FFAR4以控制脂肪生成
Omega-3 Fatty Acids Activate Ciliary FFAR4 to Control Adipogenesis.
实验完整度
高包含体外细胞系、原代细胞、体内小鼠模型和组学分析，并进行了功能验证和机制验证
主要模型
3T3-L1前脂肪细胞系 小鼠原代前脂肪细胞 人原代前脂肪细胞 Pdgfrα-CreERT Ift88条件敲除小鼠
重点核对
前脂肪细胞纤毛的条件性消除使用Pdgfrα-CreERT Ift88flox/−小鼠，他莫昔芬3周龄灌胃200–250 mg/kg连续两天 DHA cocktail成分为0.4μg/ml胰岛素、0.02mM IBMX、0.1μM Dex、100μM DHA，处理分化前2天 FFAR4激动剂TUG891体内实验为9周龄雄性C57Bl/6J小鼠每日腹腔注射35 mg/kg，持续2周后结合60% HFD 3个月 ciliary cAMP检测使用cilia-targeted cADDis BacMam传感器，FFAR4激动剂加入后每10秒成像监测5分钟 ATAC-seq使用100μM DHA或1μM Dex处理4小时，每组两个重复
摘要
成年间充质干细胞（包括前脂肪细胞）具有一种称为初级纤毛的细胞感觉细胞器。在脂肪中，纤毛化前脂肪细胞大量存在于血管周围区域，并被高脂饮食激活。在此，我们试图了解前脂肪细胞是否利用其纤毛感知外部信号并作出反应以重塑白色脂肪组织。在小鼠中消除前脂肪细胞纤毛严重损害白色脂肪组织扩张。我们发现，omega-3脂肪酸受体FFAR4/GPR120的TULP3依赖性纤毛定位促进脂肪生成。FFAR4激动剂和ω−3脂肪酸（而非饱和脂肪酸）通过快速激活纤毛内cAMP产生来触发有丝分裂和脂肪生成。纤毛cAMP激活EPAC信号、CTCF依赖性染色质重塑以及PPARγ和CEBPα的转录激活以启动脂肪生成。我们提出，膳食ω−3脂肪酸选择性驱动脂肪细胞数量扩增以产生新的脂肪细胞并储存饱和脂肪酸，从而实现健康脂肪组织的稳态。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 前脂肪细胞是否利用初级纤毛感知外部营养信号（如脂肪酸）以调控白色脂肪组织重塑和脂肪生成。
- 核心机制
- ω−3脂肪酸DHA激活纤毛FFAR4/GPR120，快速升高纤毛内cAMP，激活EPAC信号和CTCF依赖性染色质重塑，诱导PPARγ和CEBPα转录，从而启动脂肪生成。
- 主要证据
- 3T3-L1细胞、小鼠和人原代前脂肪细胞的体外分化实验、PAno cilia小鼠体内脂肪组织扩张分析、纤毛cAMP活细胞成像、RNA-seq和ATAC-seq组学分析以及CTCF敲除实验共同支持该机制。
- 研究意义
- 提出膳食ω−3脂肪酸选择性驱动脂肪细胞数量扩增以产生新脂肪细胞并储存饱和脂肪酸，从而维持健康脂肪组织稳态，并为理解ω−3脂肪酸和FFAR4的抗糖尿病效应提供可能机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
前脂肪细胞纤毛体内功能验证
验证前脂肪细胞纤毛对白色脂肪组织扩张和脂肪生成是否必需。
使用Pdgfrα-CreERT条件性敲除Ift88消除前脂肪细胞纤毛，监测体重、脂肪质量、瘦素水平、脂肪细胞大小和谱系追踪EYFP+脂肪细胞。
纤毛GPCR筛选及FFAR4纤毛定位验证
鉴定前脂肪细胞纤毛中调控脂肪生成的GPCR。
构建候选GPCR-GFP融合蛋白筛选纤毛定位；免疫荧光验证内源性FFAR4在3T3-L1、小鼠和人原代前脂肪细胞及体内血管周围细胞纤毛中的定位；TULP3敲除验证纤毛转运依赖性。
FFAR4激活对脂肪生成的调控验证
验证DHA和FFAR4激动剂是否通过FFAR4促进脂肪生成。
在3T3-L1、小鼠原代前脂肪细胞和人原代前脂肪细胞中，用DHA cocktail、FFAR4激动剂TUG891或FFAR1激动剂TUG424处理，结合FFAR4拮抗剂AH7614、TULP3或FFAR4敲除，评估Oil Red O染色和BODIPY荧光。
FFAR4激活体内促进脂肪生成验证
验证FFAR4激动剂体内处理是否促进饮食诱导的肥胖。
9周龄雄性C57Bl/6J小鼠每日腹腔注射TUG891或DMSO载体2周，第二周开始60% HFD或对照饮食3个月，监测体重。
纤毛cAMP和EPAC信号机制验证
验证FFAR4激活是否通过升高纤毛cAMP和EPAC信号启动脂肪生成。
使用纤毛靶向cAMP传感器cADDIS活细胞成像检测TUG-891刺激后纤毛cAMP变化；EdU掺入检测细胞周期再进入；使用EPAC抑制剂ESI-09和PKA抑制剂Rp-cAMPs处理分化细胞。
CTCF依赖性染色质重塑和转录调控验证
验证DHA/FFAR4是否通过CTCF介导染色质重塑激活PPARγ和CEBPα。
RNA-seq比较历史DM、DHA cocktail和对照cocktail处理24小时的3T3-L1细胞；ATAC-seq分析DHA或Dex处理4小时后的染色质可及性和转录因子motif；CTCF敲除细胞验证脂肪生成和脂肪基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 牛小牛血清 | -- | -- |
| GlutaMAX添加剂 | -- | -- | |
| 前脂肪细胞生长培养基 | PromoCell | -- | |
| 前脂肪细胞分化培养基 | PromoCell | -- | |
| 脂肪细胞营养培养基 | PromoCell | -- | |
| 药物处理 | 二十二碳六烯酸 | -- | -- |
| TUG891 | -- | -- | |
| TUG424 | -- | -- | |
| AH7614 | -- | -- | |
| T0070907 | -- | -- | |
| ESI-09 | -- | -- | |
| Rp-cAMPs | -- | -- | |
| 棕榈酸 | -- | -- | |
| 油酸 | -- | -- | |
| 他莫昔芬 | Sigma | T-5648 | |
| 地塞米松 | -- | -- | |
| IBMX | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | Pericentrin抗体 | Covance | PRB-432C |
| 乙酰化微管蛋白抗体 | Sigma | T7451 | |
| CEP170抗体 | Thermo | 41-3200 | |
| ARL13B抗体 | UC Davis/NIH NeuroMab Facility | 73-287 | |
| FFAR4抗体 | Yenzym | -- | |
| FFAR4抗体 | Santa Cruz | sc-390752 | |
| FGFR1OP抗体 | Novus | H00011116-M01 | |
| GFP抗体 | Invitrogen | A10262 | |
| 全组织染色 | CD31抗体 | BD | 553370 |
| BrdU抗体 | Cell Signaling | 5292 | |
| PDGFRα抗体 | R&D Systems | AF1062 | |
| ARL13B抗体 | Proteintech | 17711-1-AP | |
| LipidTox脂滴染料 | Invitrogen | H34475 | |
| 流式细胞术 | CD45 PE-Cy7抗体 | eBioscience | 250451-81 |
| CD31 PE-Cy7抗体 | eBioscience | 25-0311-81 | |
| TER119 PE-Cy7抗体 | eBioscience | 25-5921-81 | |
| CD34 Alexa Fluor 700抗体 | eBioscience | 56-0341-82 | |
| CD29 APC抗体 | eBioscience | 17-0291-80 | |
| SCA1 Pacific Blue抗体 | Biolegend | 108120 | |
| 原代前脂肪细胞分离 | II型胶原酶 | Sigma | C6885 |
| DNA酶 | Worthington | LS006344 | |
| 泊洛沙姆188 | Sigma | P5556 | |
| 含Earle盐的Medium 199 | Sigma | M4530 | |
| Histopaq-1077分离液 | Sigma | 10771 | |
| 抗CD45磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| 抗TER119磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-049-901 | |
| 腺病毒GFP或GFP-Cre | Vector BioLabs | 1060, 1700 | |
| Western blot | NuPage Novex 4–12% Bis-Tris蛋白凝胶 | Thermo Fisher Scientific | WG1402BOX |
| 硝酸纤维素膜 | Life Technologies | LC2001 | |
| Odyssey封闭缓冲液 | LI-COR | NC9232238 | |
| TULP3抗体 | Yenzym | -- | |
| PPARγ抗体 | Cell Signaling | 2435 | |
| 微管蛋白抗体 | Sigma | 9026 | |
| CEBPα抗体 | Cell Signaling | 8178 | |
| CTCF抗体 | Cell Signaling | 2899 | |
| ERK抗体 | Cell Signaling | 9107 | |
| 磷酸化ERK抗体 | Cell Signaling | 9101 | |
| AKT抗体 | Cell Signaling | 9272 | |
| 磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling | 9271 | |
| CREB抗体 | Cell Signaling | 9104 | |
| 磷酸化CREB抗体 | Cell Signaling | 9198 | |
| 血清分析 | 胰岛素ELISA试剂盒 | ALPCO | 80-INSMSU-E01 |
| 瘦素ELISA试剂盒 | ALPCO | 22-LEPMS-E01 | |
| 游离脂肪酸ELISA试剂盒 | Wako | NEFA-HR2 | |
| 油红O染色 | 油红O | Sigma | 00625 |
| EdU掺入 | Click-iT EdU成像试剂盒 | Thermo | C10340 |
| 活细胞成像 | BODIPY 493/503 | -- | -- |
| 活细胞纤毛cAMP检测 | cADDis BacMam cAMP传感器 | Molecular Montana | D0211G |
| 丁酸钠 | Molecular Montana | -- | |
| RT-qPCR | RNeasy脂组织RNA提取试剂盒 | QIAGEN | -- |
| M-MLV逆转录酶 | Invitrogen | 28025-013 | |
| TaqMan基因表达预混液 | Applied Biosystems | 4369016 | |
| MicroAmp光学反应板 | Applied Biosystems | N8010560 | |
| qScript cDNA合成试剂盒 | Quantabio | -- | |
| PowerUp预混液 | Invitrogen | -- | |
| 细胞培养 | Fluoromount-G封片剂 | SouthernBiotech | 0100-01 |
| Glycergel封片剂 | Dako | C056330-2 | |
| 免疫荧光 | 正常驴血清 | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 |
| 细胞培养 | 聚凝胺 | Millipore | -- |
| 0.45μm OVDF滤器 | Millipore | -- | |
| siRNA转染 | DharmaFECT试剂1 | Dharmacon | -- |
| 细胞培养 | Fugene6转染试剂 | Promega | -- |
| ATAC-seq | 洋地黄皂苷 | Promega | -- |
| MinElute PCR纯化柱 | Qiagen | -- | |
| NextSeq500测序仪 | Illumina | -- | |
| RNA-seq | Illumina HiSeq4000测序仪 | Illumina | -- |
| 活细胞成像 | IncuCyte活细胞分析成像系统 | Essen Bioscience | -- |
| 动物实验 | EchoMRI3in1™体成分分析仪 | Echo Medical System | -- |
| 综合实验室动物监测系统 | Columbus Instruments, Inc. | -- | |
| 60%高脂饮食 | ResearchDiets | D12492 | |
| 匹配对照饮食 | ResearchDiets | D12450J | |
| 繁殖鼠粮 | Lab Diet | #5058 | |
| BrdU | Abcam | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 前脂肪细胞纤毛体内功能验证 | 他莫昔芬给药年龄（3周龄或6周龄）、剂量200–250 mg/kg、连续两天口服灌胃；PAno cilia小鼠基因型Pdgfrα-CreERT Ift88flox/−；对照基因型Ift88flox/−或Pdgfrα-CreERT Ift88flox/+ 阅读提示：Methods 'In vivo animal studies'及Figure 2 legend、Figure S2 |
| 3T3-L1体外脂肪生成 | DHA cocktail浓度（0.4μg/ml胰岛素、0.02mM IBMX、0.1μM Dex、100μM DHA）处理前2天；对照cocktail以EtOH/DMSO替代DHA；分化后维持培养基含1μg/ml胰岛素；总分化时间4–8天 阅读提示：Methods 'In vitro Adipogenesis'及Figure 5、Figure S5 |
| FFAR4激动剂体内实验 | 9周龄雄性C57Bl/6J小鼠每日腹腔注射TUG891 35 mg/kg或10% DMSO载体；注射2周后第二周开始60% HFD或对照饮食3个月 阅读提示：Methods 'In vivo animal studies'及Figure 5F |
| 纤毛cAMP活细胞检测 | cADDis BacMam传感器感染量25μl，含2mM丁酸钠，37°C孵育6小时后换含1mM丁酸钠培养基16–24小时；成像每10秒一次共5分钟，激动剂30秒后加入 阅读提示：Methods 'Live Cell Ciliary cAMP assay'及Figure 6E–F、Figure S6E |
| ATAC-seq和转录因子motif分析 | 3T3-L1细胞100μM DHA或1μM Dex处理4小时，2个重复；ATAC-seq使用Tn5转座酶和自定Nextera引物；测序平台NextSeq500，2×76 bp 阅读提示：Methods 'ATACseq and TF motif enrichment analysis'及Figure 7E |