鉴定cGAS乙酰化位点
确定cGAS在静息细胞中的乙酰化修饰位点。
在THP-1细胞中表达FLAG-cGAS，免疫沉淀后经LC-MS鉴定乙酰化位点。
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乙酰化阻断cGAS活性并抑制自身DNA诱导的自身免疫
Acetylation Blocks cGAS Activity and Inhibits Self-DNA-Induced Autoimmunity.
实验完整度
高包含体外重组蛋白、细胞系、原代细胞、小鼠模型和患者PBMC多层级证据，并有功能与机制验证
主要模型
THP-1细胞及cGAS敲除回补细胞系 HEK293T-STING细胞 Trex1−/−小鼠 AGS患者及其健康兄弟的PBMC
重点核对
cGAS乙酰化位点：K384、K394、K414的K-to-Q/K-to-R突变体及位点特异性乙酰化重组蛋白 THP-1细胞中cGAS敲除后回补野生型或乙酰化模拟突变体，HT-DNA刺激浓度2 μg/mL 阿司匹林处理浓度4 mM，处理时间24 h，用于细胞乙酰化检测 Trex1−/−小鼠每日腹腔注射阿司匹林50 mg/kg，持续7天或10天 AGS患者PBMC经阿司匹林4 mM处理2天，检测ISG表达
摘要
细胞质中DNA的存在通常是微生物感染的标志，并会被环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）快速检测以引发抗感染免疫反应。然而，自身DNA对cGAS的慢性激活会导致严重的自身免疫性疾病，目前尚无有效治疗方法。在此我们报告，乙酰化抑制cGAS激活，并且阿司匹林强制乙酰化cGAS可强效抑制自身DNA诱导的自身免疫。我们发现，cGAS在Lys384、Lys394或Lys414任一赖氨酸位点的乙酰化有助于保持cGAS失活。cGAS在DNA刺激下会发生去乙酰化。重要的是，我们证明阿司匹林能直接乙酰化cGAS并有效抑制cGAS介导的免疫反应。最后，我们证明阿司匹林能有效抑制Aicardi-Goutières综合征（AGS）患者细胞和AGS小鼠模型中的自身DNA诱导的自身免疫。因此，我们的研究揭示了乙酰化有助于调控cGAS活性，并为治疗DNA介导的自身免疫疾病提供了潜在疗法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 乙酰化是否调控cGAS活性，以及阿司匹林能否通过乙酰化cGAS抑制自身DNA诱导的自身免疫。
- 核心机制
- cGAS在K384、K394或K414位点的乙酰化抑制其活性；DNA刺激通过HDAC3介导cGAS去乙酰化从而激活cGAS；阿司匹林直接乙酰化cGAS并抑制其激活。
- 主要证据
- 通过LC-MS鉴定乙酰化位点，K-to-Q突变体和位点特异性乙酰化重组蛋白抑制cGAS活性和cGAMP合成；阿司匹林乙酰化cGAS并抑制DNA诱导的IRF3磷酸化和IFN-β产生；在Trex1−/−小鼠和AGS患者PBMC中阿司匹林抑制ISG表达并延长小鼠生存。
- 研究意义
- 揭示了乙酰化调控cGAS活性的新机制，并提示阿司匹林可作为治疗AGS和其他DNA介导自身免疫疾病的潜在疗法。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证乙酰化模拟突变对cGAS活性的影响
检测K-to-Q或K-to-R突变对cGAS活性的影响。
在HEK293T-STING细胞中转染cGAS突变体，免疫印迹检测IRF3磷酸化；在cGAS敲除THP-1细胞中回补突变体，检测IRF3磷酸化、IFNB1 mRNA和cGAMP产生。
体外验证位点特异性乙酰化对cGAS活性的影响
明确特定位点乙酰化对cGAS酶活性和DNA结合的影响。
利用遗传密码扩展系统合成位点特异性乙酰化cGAS重组蛋白，进行体外cGAMP合成实验和DNA结合实验。
检测DNA刺激对cGAS乙酰化的调控
研究DNA刺激是否引起cGAS去乙酰化及其机制。
用HT-DNA或HSV-1处理细胞，免疫沉淀检测cGAS乙酰化；免疫共沉淀和免疫荧光检测HDAC3与cGAS相互作用；siRNA敲低HDAC3后检测cGAS乙酰化和IRF3磷酸化。
验证阿司匹林对cGAS的乙酰化作用
检测阿司匹林是否能直接乙酰化cGAS并抑制其活性。
将阿司匹林与重组cGAS蛋白孵育，或用阿司匹林处理细胞，通过免疫印迹和质谱检测cGAS乙酰化；检测阿司匹林对cGAMP产生和IRF3磷酸化的影响。
验证阿司匹林在体内抑制cGAS介导的IFN产生
检测阿司匹林是否能在小鼠体内抑制DNA病毒诱导的IFN-β产生。
C57BL/6J小鼠每日腹腔注射阿司匹林或DMSO，2天后感染HSV-1或VSV，6小时后检测血清IFN-β。
验证阿司匹林对自身DNA诱导自身免疫的治疗效果
检测阿司匹林能否缓解Trex1−/−小鼠的自身免疫表型。
Trex1−/−小鼠每日腹腔注射阿司匹林、水杨酸、双氯芬酸钠或DMSO，检测心脏ISG表达、脾脏cGAS乙酰化和小鼠生存率。
验证阿司匹林对AGS患者细胞的作用
检测阿司匹林能否降低AGS患者PBMC中升高的ISG表达。
分离AGS患者及其健康兄弟的PBMC，用阿司匹林或DMSO处理，检测ISG mRNA水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达与修饰变化
验证酶活性与结合能力
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 佛波酯 | Merck | 524400; CAS No.16561-29-8 |
| 嘌呤霉素盐酸盐 | Amresco | J593-25MG; CAS No.58-58-2 | |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | H9268; CAS No. 28728-55-4 | |
| 人淋巴细胞分离液 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| 脂质体2000 | Invitrogen | -- | |
| VigoFect转染试剂 | Vigorous Biotechnology | -- | |
| RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 药物处理 | 阿司匹林 | Ouhe Technology | 50-78-2; CAS No.50-78-2 |
| 氘代阿司匹林 | Santa Cruz Biotechnology | sc-480464; CAS No.921943-73-9 | |
| 水杨酸 | Alfa Aesar | 30782; CAS No. 69-72-7 | |
| 双氯芬酸钠 | Aladdin | D129332; CAS No. 15307-79-6 | |
| MS-275 | MedChemExpress | HY-12163; CAS No. 209783-80-2 | |
| RGFP966 | Selleck | S7229; CAS No. 1396841-57-8 | |
| BX-795 | Selleck | S1274; CAS No. 702675-74-9 | |
| 细胞刺激 | 鲱鱼睾丸DNA | Sigma-Aldrich | D6898 |
| 2′3′-环鸟苷酸-腺苷酸 | Invivogen | tlrl-cga23 | |
| 环二鸟苷酸 | Invivogen | tlrl-cdg | |
| 聚肌胞苷酸 | Sigma-Aldrich | P1530 | |
| 洋地黄皂苷 | Sigma | D141 | |
| 蛋白纯化 | 镍-次氮基三乙酸琼脂糖珠 | QIAGEN | Mat. No. 1018244 |
| HisTrap FF层析柱 | GE Healthcare | 17-5319-01 | |
| 蛋白G琼脂糖珠 | GE Healthcare | 17-0618-01 | |
| 免疫印迹 | 抗磷酸化TBK1/NAK (Ser172)兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 5483P |
| 抗TBK1兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3504S | |
| 抗cGAS（小鼠特异性）兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 31659 | |
| 抗cGAS兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 15102 | |
| 抗乙酰化赖氨酸兔多克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9441 | |
| 抗乙酰化赖氨酸小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9681S | |
| 抗α-微管蛋白小鼠单克隆抗体 | Sigma-Aldrich | T5168 | |
| 抗FLAG小鼠单克隆抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| 抗HDAC3兔单克隆抗体 | Abcam | ab32369 | |
| 抗磷酸化IRF3 (S386)兔单克隆抗体 | Abcam | ab76493 | |
| 抗IRF3兔单克隆抗体 | Abcam | ab68481 | |
| 抗TREX-1小鼠单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-271870 | |
| 抗β-肌动蛋白小鼠单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| 抗HA探针兔多克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-805 | |
| 抗HDAC3小鼠单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-376957 | |
| 抗His标签兔多克隆抗体 | MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES | PM032 | |
| 免疫沉淀 | 抗cGAS兔多克隆抗体 | This paper | -- |
| 抗乙酰化cGAS (K384+K394)兔多克隆抗体 | This paper | -- | |
| 抗乙酰化cGAS (K414)兔多克隆抗体 | This paper | -- | |
| ELISA | 小鼠IFN-β ELISA试剂盒 | Biolegend | 439408 |
| 人PGE2 ELISA试剂盒 | FineTest | EH4233 | |
| qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596018 |
| PrimeScript逆转录预混液 | TAKARA | RR036A | |
| FastStart通用SYBR Green预混液(Rox) | Roche | 04913914001 | |
| 细胞活力检测 | CellTiter 96® AQueous One Solution细胞增殖检测试剂 | Promega | G3580 |
| 蛋白纯化 | Nε-乙酰-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | A4021; CAS No.692-04-6 |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | N0636; CAS No.98-92-0 | |
| 曲古抑菌素A | Cell Signaling Technology | 9950S; CAS No.58880-19-6 | |
| 细胞刺激 | ATP溶液（100 mM） | ThermoFisher Scientific | R0441 |
| GTP溶液（100 mM） | ThermoFisher Scientific | R0461 | |
| 细胞培养 | 重组人TNF-α蛋白 | R&D System | 210-TA |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| cGAS乙酰化位点鉴定 | 细胞模型（FLAG-cGAS稳定表达THP-1）、免疫沉淀条件、LC-MS参数 阅读提示：Results 'Acetylation-Mimicking Mutation of cGAS Blocks cGAS Activation'及STAR Methods 'Mass Spectrometry' |
| 乙酰化模拟突变体功能验证 | HEK293T-STING细胞转染突变体、THP-1 cGAS敲除回补、HT-DNA浓度（2 μg/mL）和处理时间（3或6 h）、cGAMP检测方法（LC-MS/MRM） 阅读提示：Figure 1及legend、STAR Methods 'Quantification of cGAMP using LC-MS/MRM' |
| 位点特异性乙酰化重组蛋白活性分析 | 重组蛋白制备（遗传密码扩展）、体外cGAMP合成条件（HT-DNA 20 μg/mL、ATP/GTP 2 mM、37°C 2 h）、DNA结合实验浓度范围 阅读提示：Figure 2及legend、STAR Methods 'Purification of site-specific acetylated cGAS recombinant proteins'和'In vitro cGAMP synthesis assay' |
| 阿司匹林处理细胞 | 阿司匹林浓度（4 mM）、溶剂（Opti-MEM，pH<7）、处理时间（24 h或1-2天） 阅读提示：Results 'Enforced Acetylation of cGAS by Aspirin'、STAR Methods 'Cells' |
| Trex1−/−小鼠体内治疗实验 | 小鼠周龄（3周）、给药剂量（阿司匹林50 mg/kg、水杨酸50 mg/kg、双氯芬酸钠1 mg/kg、MS-275 20 mg/kg）、给药途径（腹腔注射）、持续时间（7天或10天）、检测组织（心脏、脾脏） 阅读提示：Figure 6及legend、STAR Methods 'Mice' |
| AGS患者PBMC实验 | 患者TREX1突变信息（c.459_460insA）、PBMC分离方法（HISTOPAQUE-1077）、阿司匹林浓度（4 mM）和处理时间（2天） 阅读提示：Figure 7及legend、STAR Methods 'Isolation of PBMCs from AGS patient' |